類胰蛋白酶激活小膠質(zhì)細胞PAR2介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用.pdf

1、[研究背景及目的]
　　 小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細胞，其在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)微環(huán)境的動態(tài)平衡中扮演重要角色。近年來，研究認(rèn)為神經(jīng)元-小膠質(zhì)細胞的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)失衡與神經(jīng)元損傷及中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病密切相關(guān)。其中，小膠質(zhì)細胞活化后介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)和氧化損傷已成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究熱點之一。目前，越來越多的研究證實活化的小膠質(zhì)細胞可促進一氧化氮(nitricoxide，NO)、腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis

2、factor-α，TNF-α)等炎癥因子的釋放。然而，小膠質(zhì)細胞活化的調(diào)控及其介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的分子機制十分復(fù)雜，尚待進一步研究闡明。
　　 蛋白酶激活受體2(protease-activatedreceptor2，PAR2)是與G蛋白相偶聯(lián)的受體，屬于蛋白酶激活受體(protease-activatedreceptors，PARs)家族成員之一，主要被胰蛋白酶和類胰蛋白酶等激活，其獨特的激活方式及廣泛的病理生理作用，使其有望作

3、為重要的藥物干預(yù)靶點而受到越來越多關(guān)注。近年來，研究發(fā)現(xiàn)PAR2廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和退行性疾病等病理過程中扮演重要角色。目前，研究人員普遍認(rèn)為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中PAR2的激活可表現(xiàn)出“保護”和“損害”的雙重作用，并推測其可能與細胞類型及疾病所處的病理階段不同等因素相關(guān)，但具體作用機制仍不明確。最近研究發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶可激活星形膠質(zhì)細胞表面PAR2，通過MAPK-NF-κB通路促進NO的合成與釋放。目前，針對小膠質(zhì)細胞

4、PAR2激活介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的研究還十分有限。我們前期研究中發(fā)現(xiàn)，活化的肥大細胞可釋放類胰蛋白酶激活小膠質(zhì)細胞表面PAR2，引起小膠質(zhì)細胞活化，小膠質(zhì)細胞活化后同樣通過MAPK通路促進BDNF的合成與釋放。因此，我們推測外源性添加類胰蛋白酶可激活小膠質(zhì)細胞表面PAR2，進而促進小膠質(zhì)細胞合成和釋放NO、TNF-α等炎癥因子，介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致周圍神經(jīng)元損傷。
　　 綜上所述，鑒于小膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎癥反應(yīng)中的重要作

5、用，本課題通過體外原代細胞培養(yǎng)等技術(shù)，研究類胰蛋白酶激活小膠質(zhì)細胞PAR2后不同時間點NO、TNF-α、IL-1β等炎癥因子的釋放情況，并觀察其對體外培養(yǎng)神經(jīng)元存活的影響，旨在探索PAR2在小膠質(zhì)細胞活化及其介導(dǎo)神經(jīng)炎癥反應(yīng)中的作用，也期望為開發(fā)更有效的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷防治新策略提供作用靶點，具有理論和臨床意義。
　　 [研究方法]
　　 1.類胰蛋白酶干預(yù)小膠質(zhì)細胞，檢測不同時間點培養(yǎng)上清液中BDNF、IL-1β、TN

6、F-α及NO的含量。
　　 體外分離純化培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)原代小膠質(zhì)細胞，添加類胰蛋白酶(Tryptase)20U/ml，隨后分別在第0,0.5，1，2，12，24和72h收集小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)上清液(microgliaconditioningmedium，MCM)，通過ELISA法檢測上清液中BDNF、IL-1β及TNF-α含量，Griess法測定上清液中NO2-含量作為衡量NO水平的指標(biāo)。
　　 2.利用PAR2特異性激動劑、

7、抑制劑及RNA干擾技術(shù)，探索PAR2在類胰蛋白酶激活小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的作用。
　　 體外分離純化培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞，實驗分4組。對照組；實驗組一：體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞+SLIGRL-NH2(PAR2特異性激動劑)；實驗組二：體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞+FSSRY-NH2(PAR2特異性抑制劑)+Trypmse；實驗組三：體外培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞+PAR2shRNA+Tryptase，24h后收集細胞培養(yǎng)上清液，Griess法測定比較

8、不同組別NO水平。
　　 3.類胰蛋白酶激活小膠質(zhì)細胞對體外培養(yǎng)神經(jīng)元存活的影響。
　　 體外分離培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元，實驗分3組。對照組：體外培養(yǎng)神經(jīng)元+未經(jīng)類胰蛋白酶處理的MCM；早期組：體外培養(yǎng)神經(jīng)元+類胰蛋白酶處理后第1h收集MCM；晚期組：體外培養(yǎng)神經(jīng)元+第72h收集的MCM，再培養(yǎng)神經(jīng)元48h，隨后通過流式細胞技術(shù)和TUNEL染色檢測神經(jīng)元凋亡情況。
　　 4.統(tǒng)計學(xué)處理
　　 數(shù)據(jù)使用SPSS

9、13.0統(tǒng)計軟件進行分析，結(jié)果以X±SD表示。多組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，p≤0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 [研究結(jié)果]
　　 1.類胰蛋白酶干預(yù)早期BDNF釋放短暫性升高，晚期TNF-α等炎癥因子含量逐漸增加
　　 檢測結(jié)果顯示，類胰蛋白酶激活小膠質(zhì)細胞后早期MCM中BDNF含量迅速增加，在1h釋放達到高峰，但72h內(nèi)逐漸下降至起始水平；與之相反，IL-1β、TNF-α及

10、NO的含量則隨時間推移逐漸升高，在最后一次測量時間點(72h)仍保持較高水平。
　　 2.類胰蛋白酶通過激活小膠質(zhì)細胞PAR2介導(dǎo)炎癥反應(yīng)
　　 PAR2特異性激動劑SLIGRL-NH2顯著增加小膠質(zhì)細胞培養(yǎng)上清液中NO的含量，與對照組相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(11.24±1.09VS2.25±0.26，p＜0.05)；用PAR2抑制劑和慢病毒預(yù)處理小膠質(zhì)細胞后，再用類胰蛋白酶干預(yù)小膠質(zhì)細胞，培養(yǎng)上清液中NO的含量與對照

11、組相比，無明顯差異(2.53±0.40VS2.25±0.26，p＞0.05；2.25±0.27VS2.25±0.26，p＞0.05)，表明類胰蛋白酶是通過激活PAR2介導(dǎo)小膠質(zhì)細胞NO的釋放。
　　 3.類胰蛋白酶干預(yù)晚期的MCM促進體外培養(yǎng)神經(jīng)元凋亡
　　 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果：晚期組神經(jīng)元凋亡率明顯增加，與對照組和早期組相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(13.60％±1.51％VS3.33％±0.51％，p＜0.05；13.6

12、0％±1.51％VS3.27％±0.42％，p＜0.05)；而早期組和對照組相比較，神經(jīng)元凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(3.33％±0.51％VS3.27％±0.42％，p＞0.05)。TUNEL染色結(jié)果：晚期組免疫熒光強度和陽性細胞數(shù)明顯高于對照組和早期組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(17.67％±0.45％VS5.57％±1.35％，p＜0.05；17.67％±0.45％VS6.67％±0.47％，p＜0.05)。
　　 [研究結(jié)論]