PKC-COX-2介導人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞多藥耐藥的實驗研究.pdf

1、第一部分人神經(jīng)膠質(zhì)瘤耐阿霉素細胞株的建立及其生物學特性 目的： 建立人神經(jīng)膠質(zhì)瘤阿霉素耐藥細胞株SHG44/ADM，并初步探討其發(fā)生多藥耐藥的可能機制。 方法： 1、應(yīng)用阿霉素濃度遞增和間歇誘導法建立SHG44/ADM耐藥株。 2、采用CCK-8法檢測不同抗腫瘤藥物對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響，計算半數(shù)抑制率(IC50)和耐藥指數(shù)(RI)，觀察凍存、撤藥對耐藥穩(wěn)定性的影響。 3、比較耐藥株

2、與親本細胞株細胞形態(tài)、細胞貼壁率、生長曲線、群體倍增時間的差異。 4、雙層軟瓊脂實驗測SHG44/WT和SHG44/ADM克隆形成率。 5、流式細胞儀檢測SHG44/WT和SHG44/ADM細胞周期。 6、RT-PCR檢測MDR-1、MRP1和LRP的mRMA表達量，免疫印跡法檢測MDR-1、MRP1、LRP、COX-2和PKC的蛋白表達量。 7、羅丹明實驗測SHG44/WT和SHG44/ADM對藥物的攝

3、入、排出能力。 8、流式細胞儀和熒光顯微鏡檢測SHG44/WT和SHG44/ADM細胞的凋亡率。 結(jié)果： 1、SHG44/ADM對阿霉素的耐藥指數(shù)為10.7，凍存對耐藥無明顯影響，而撤藥可降低耐藥性，而且SHG44/ADM對多種抗腫瘤藥物均產(chǎn)生不同程度的耐藥性。 2、SHG44/ADM相對于SHG44/WT細胞形態(tài)無明顯差異，但生長曲線緩慢，細胞群體倍增時間延長(32.22±0.52h vs 26.67±

4、0.49 h)。 3、SHG44/WT親本細胞和SHG44/ADM耐藥細胞克隆形成率分別為：20％，52％，耐藥細胞的克隆形成率顯著增加。 4、相對于親本 SHG44/WT細胞(G1 期為31.40±5.7，S 期為19.60±3.5，G2/M 期為39.3±4.9)，SHG44/ADM 耐藥細胞(G1 期為45.47±6.8，S 期為35.73±5.3，G2/M 期7.8±2.6)的G1，S期所占比例增加，G2 期所占

5、比例減少。 5、RT-PCR檢測SHG44/ADM耐藥細胞株MDR-1的mRMA表達量明顯增強，而MRP1、LRP無明顯變化。 6、免疫印跡發(fā)現(xiàn)SHG44/ADM耐藥細胞株MDR1表達明顯增強，而MRP1和LRP表達無明顯變化，COX-2和PKC口的蛋白表達量增強。 7、SHG44/ADM對羅丹明攝入減少，排出增多。 8、熒光顯微鏡分析表明ADM對耐藥細胞SHG44/ADM的凋亡率明顯減少，加入MDR1抑

6、制劑干預后可明顯增加ADM對SHG44/ADM細胞的凋亡率。 結(jié)論： 1、成功建立人神經(jīng)膠質(zhì)瘤阿霉素耐藥細胞株SHG44/ADM。 2、SHG44/ADM耐藥機制可能與MDR1的表達增加，抗癌藥物攝入減少，外排增多，減少藥物對腫瘤細胞的凋亡作用相關(guān)。 3、阿霉素耐藥細胞株SHG44/ADM的COX-2和PKC□的蛋白表達量增強。 第二部分PKC、COX-2在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞多藥耐藥中的作用及其機制

7、的研究 目的： 探討PKC□、COX-2在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞多藥耐藥中的作用，分析PKC□、COX-2、MDR1三者之間的關(guān)系，揭示人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞發(fā)生多藥耐藥的機制。 方法： 1、采用CCK-8法檢測阿霉素對不同處理方式人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖作用影響，計算半數(shù)抑制率(IC50)和耐藥指數(shù)(RI)。 2、臺盼藍拒染試驗分析存活細胞和死亡細胞的數(shù)目。 3、免疫印跡法檢測MDR-1、COX-2和

8、PKC□的蛋白表達量4、激酶分析PKC的活性。 5、酶聯(lián)免疫分析PGE2的生成量。 6、熒光分光光度計檢測細胞內(nèi)阿霉素的濃度。 7、流式細胞儀檢測細胞凋亡率。 結(jié)果： 1、與SHG44/WT細胞相比，SHG44/ADM 細胞對阿霉素的半數(shù)抑制率、耐藥指數(shù)和細胞存活率增高(P<0.05)，PKC□蛋白表達和 PKC活性增加，COX-2蛋白表達和PGE2生成量也增加，MDR1蛋白表達增加，細胞內(nèi)阿霉素

9、濃度降低，10□g/ml 阿霉素處理細胞后凋亡率減少。用10□M濃度的PKC抑制劑Staurosporine干預SHG44/ADM后其對阿霉素的半數(shù)抑制率、耐藥指數(shù)和細胞存活率降低(P<0.05)，PKC□蛋白表達增加但PKC活性明顯降低，COX-2蛋白表達和PGE2生成量減少，細胞內(nèi)阿霉素濃度增高，10□g/ml阿霉素處理細胞后其凋亡率增加(均相對于SHG44/ADM細胞)。 用25□M濃度的COX-2特異性抑制劑NS398處

10、理SHG44/ADM細胞后其對阿霉素的半數(shù)抑制率、耐藥指數(shù)和細胞存活率降低(P<0.05)，PKC□蛋白表達和PKC活性無明顯變化，COX-2蛋白表達增加但PGE2生成量明顯減少，細胞內(nèi)阿霉素濃度增高，10□g/ml阿霉素處理細胞后其凋亡率增加(均相對于SHG44/ADM 細胞)。 2、與SHG44/WT細胞相比，100ng/mlPMA處理的SHG44/WT細胞后其對阿霉素的半數(shù)抑制率、耐藥指數(shù)和細胞存活率增高(P<0.05)，

11、PKC□蛋白表達和PKC活性增加，COX-2蛋白表達和PGE2生成量也增加，細胞內(nèi)阿霉素濃度降低，10□g/ml阿霉素處理細胞后其凋亡率減少。 用10□M 濃度的PKC抑制劑Staurosporine干預100ng/mlPMA處理的SHG44/WT細胞后其對阿霉素的半數(shù)抑制率、耐藥指數(shù)和細胞存活率降低(P<0.05)，PKC□蛋白表達增加但 PKC 活性明顯降低(P<0.01)，COX-2蛋白表達和PGE2生成量減少，細胞內(nèi)阿霉

12、素濃度增高，10□g/ml阿霉素處理細胞后其凋亡率增加(均相對于100ng/mlPMA處理的SHG44/WT細胞)。用25□M濃度的COX-2特異性抑制劑NS398處理100ng/mlPMA處理的SHG44/WT細胞后其對阿霉素的半數(shù)抑制率、耐藥指數(shù)和細胞存活率降低(P<0.05)，PKC□蛋白表達和PKC活性無明顯變化，COX-2蛋白表達增加但 PGE2 生成量明顯減少，細胞內(nèi)阿霉素濃度增高，10□g/ml阿霉素處理細胞后其凋亡率增加

13、(均相對于 100ng/mlPMA 處理的SHG44/WT細胞)。 3、與SHG44/WT細胞相比，轉(zhuǎn)染10□g/mlpCMV-COX2質(zhì)粒的SHG44/WT細胞后其對阿霉素的半數(shù)抑制率、耐藥指數(shù)和細胞存活率明顯增高(P<0.01)，PKC□蛋白表達和PKC活性無明顯變化，COX-2蛋白表達和PGE2生成量顯著增DH(P<0.01)，細胞內(nèi)阿霉素濃度明顯降低，10□g/ml阿霉素處理細胞后其凋亡率明顯減少。 用10□M濃

14、度的PKC抑制劑Staurosporine干預轉(zhuǎn)染10□g/mlpCMV-COX2質(zhì)粒的SHG44/WT細胞后其對阿霉素的半數(shù)抑制率、耐藥指數(shù)和細胞存活率無明顯變化，PKC口蛋白表達增加但PKC活性降低，COX-2蛋白表達和PGE2生成量無變化，細胞內(nèi)阿霉素濃度無明顯變化，10□g/ml阿霉素處理細胞后其凋亡率無明顯變化(均相對于轉(zhuǎn)染10□g/mlpCMV-COX2質(zhì)粒的SHG44/WT細胞)。 用25□M濃度的COX-2特異性

15、抑制劑NS398處理轉(zhuǎn)染10□g/mlpCMV -COX2質(zhì)粒的SHG44/WT細胞后其對阿霉素的半數(shù)抑制率、耐藥指數(shù)和細胞存活率降低(P<0.01)，PKC□蛋白表達和PKC活性無明顯變化，COX-2蛋白表達增加但PGE2生成量明顯減少，細胞內(nèi)阿霉素濃度增高，10□g/ml阿霉素處理細胞后其凋亡率明顯增加(均相對于轉(zhuǎn)染10□g/ml pCMV-COX2質(zhì)粒的SHG44/WT細胞)。 結(jié)論： 1、PKC□蛋白表達和PKC