水通道蛋白1影響內(nèi)源性氧自由基的轉(zhuǎn)運(yùn).pdf

1、目的
　　水通道蛋白(AQPs)廣泛存在于各種組織和細(xì)胞中，它最基本的功能是維持細(xì)胞內(nèi)外水環(huán)境的穩(wěn)定，最先發(fā)現(xiàn)的AQP1是目前分布最廣的一種AQPs，最近研究顯示它尚與H2O2向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。氧自由基(ROS)是需氧細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生一系列活性氧簇，生物學(xué)上最重要的是O2(.)-和H2O2。細(xì)胞能量代謝發(fā)生障礙時(shí)可導(dǎo)致ROS大量產(chǎn)生，既然AQP1可將細(xì)胞外H2O2轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，我們猜測(cè)它是否也可以將細(xì)胞內(nèi)大量產(chǎn)生的ROS轉(zhuǎn)運(yùn)出

2、細(xì)胞呢？本實(shí)驗(yàn)的主要目的既是通過特異性siRNA轉(zhuǎn)染抑制AQP1表達(dá)，再予能量代謝抑制劑處理后檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化及予外源性H2O2刺激細(xì)胞后檢測(cè)AQP1表達(dá)，初步探索AQP1對(duì)內(nèi)源性ROS轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。
　　方法
　　1、實(shí)驗(yàn)分三組:AQP1-RNAi為特異性靶向AQP1的siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞;control-RNAi為非特異性靶向AQP1的siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞;normalcell，為正常細(xì)胞，分2個(gè)亞組。wester

3、nblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后AQP1蛋白表達(dá)量;AQP1-RNAi、control-RNAi、normalcell三組分別加入碘乙酰胺(30μM)孵育0、4、6小時(shí)，裝載DCFH-DA探針，另外一組normalcell作為空白對(duì)照，酶標(biāo)儀檢測(cè)ROS熒光值。
　　2、應(yīng)用寡霉素(40μM)作用于Balb/c3T3成纖維細(xì)胞，分別孵育0、2、4小時(shí)，裝載DCFH-DA探針，酶標(biāo)儀檢測(cè)ROS熒光值。
　　3、應(yīng)用H2O2(125μM)作用

4、于Balb/c3T3成纖維細(xì)胞，分別孵育0、1、3、5小時(shí)，westernblot檢測(cè)AQP1蛋白量。
　　結(jié)果
　　1、利用RNAi轉(zhuǎn)染技術(shù)抑制Balb/c3T3成纖維細(xì)胞AQP1表達(dá)，westernblot驗(yàn)證AQP1蛋白表達(dá)量。AQP1-RNAi組AQP1表達(dá)較normalcell組減少63.9％，control-RNAi組較normalcell組減少20.3％。
　　2、細(xì)胞中加入碘乙酰胺(30μM)后孵育0、

5、4、6小時(shí)，裝載DCFH-DA探針，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光值，AQP1-RNAi、control-RNAi、normalcell三組加入碘乙酰胺4、6小時(shí)ROS數(shù)量均明顯增加，與0小時(shí)對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而AQP1-RNAi組與control-RNAi、normalcell兩組于不同時(shí)間對(duì)比ROS升高更為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;normalcell+DCFH-DA與normalcell組對(duì)比明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3、應(yīng)用寡霉素(40μM