黃綠青霉素通過ROS介導(dǎo)HepG2細胞自噬性死亡的實驗研究.pdf

1、目的:黃綠青霉素(citreoviridin，CIT)是由發(fā)霉谷物產(chǎn)生出的次級代謝產(chǎn)物，例如玉米、大米等。研究發(fā)現(xiàn)黃綠青霉素在大米中生長速度最快，產(chǎn)毒數(shù)量最高。很多大米消費水平高的發(fā)展中國家由于溫度較高、氣候潮濕等儲物條件有利于真菌的生長和毒素的產(chǎn)生，因此在這些國家黃綠青霉素污染較嚴(yán)重，成為一個不可忽視的重大的公共衛(wèi)生問題。黃綠青霉素已經(jīng)被證實與多種疾病有關(guān)。肝臟是解毒的重要器官也是很多真菌毒素的靶器官。動物攝入的黃綠青霉素主要集中于中

2、樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腎臟和心臟。黃綠青霉素肝臟毒性的分子機制尚未完全明確。細胞自噬是近些年來的研究熱點，自噬是指細胞內(nèi)受損的細胞器及大分子物質(zhì)包裹于雙層或多層膜結(jié)構(gòu)，形成自噬小體，而自噬小體與溶酶體融合并對其內(nèi)容物進行消化的過程。正常水平的自噬是一種通過降解胞內(nèi)異常組分以維持細胞穩(wěn)態(tài)的機制，然而自噬水平過度上調(diào)則引起細胞自噬性死亡。本實驗?zāi)康脑谟谘芯奎S綠青霉素是否改變了細胞自噬的過程及自噬在黃綠青霉素肝臟毒性中所發(fā)揮的作用，是保護肝臟細胞

3、還是促進肝臟細胞的死亡。本研究可以進一步加深對黃綠青霉素肝臟毒性分子機制的理解。
　　方法:本實驗以HepG2細胞作為研究對象。用MTT（四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法）檢測不同劑量黃綠青霉素處理后的HepG2細胞存活率的變化;預(yù)先使用不同試劑（自噬抑制劑3-MA、自噬激活劑雷帕霉素、siRNA Atg5、活性氧抑制劑NAC）處理后，用黃綠青霉素處理HepG2細胞，檢測細胞存活率的變化;用相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化;用透射電子顯

4、微鏡觀察細胞自噬小體的超微結(jié)構(gòu);用熒光顯微鏡觀察經(jīng)Cyto-ID(R)Green染色的自噬小體熒光強弱的變化;用Western blot（蛋白質(zhì)免疫印跡法）檢測黃綠青霉素處理的LC3（細胞內(nèi)自噬標(biāo)記物-微管相關(guān)蛋白輕鏈3）和P62蛋白表達量的變化;用LC3-turnover實驗鑒別細胞內(nèi)聚集的自噬小體是由自噬小體增多所致，還是由自噬小體降解障礙所致;用DCFH-DA（2'，7'-二氫二氯熒光素）檢測不同劑量黃綠青霉素處理的細胞內(nèi)ROS的

5、含量變化。
　　結(jié)果:經(jīng)過不同濃度黃綠青霉素(0μM、1.25μM、2.5μM、5μM)染毒24小時后，隨著CIT濃度的增加HepG2細胞存活率明顯下降;用自噬抑制劑3-MA(3-Methyladenine)、ROS（Reactive oxygen species，活性氧）抑制劑NAC(N-乙酰半胱氨酸)和siRNA Atg5干預(yù)后，細胞存活率與對照組相比明顯增高;用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素預(yù)處理4小時，細胞存活率與對照組相比明顯下降。

6、用相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)變化可進一步證實以上結(jié)論。電子顯微鏡下可明顯觀察到自噬小體的雙層或多層膜結(jié)構(gòu)，且自噬小體數(shù)量增加。熒光顯微鏡下觀察到細胞內(nèi)的自噬小體隨著黃綠青霉素劑量升高而逐漸增多。LC3-Ⅱ蛋白表達隨黃綠青霉素濃度增加而增加，P62蛋白表達隨黃綠青霉素濃度增加而減少;在LC3-turnover實驗中，用自噬小體與溶酶體融合的抑制劑Cq（chloroquine，氯喹）處理后，與對照組相比LC3-Ⅱ蛋白表達量明顯增多，這說明聚集

7、的自噬小體是由自噬小體生成增多所致，而不是由自噬小體降解障礙引起;用活性氧ROS抑制劑NAC預(yù)處理1小時后，與對照組相比LC3-Ⅱ蛋白表達量明顯減少。細胞內(nèi)活性氧水平隨黃綠青霉素劑量的升高而升高;用ROS抑制劑NAC預(yù)處理HepG2細胞可有效降低活性氧水平，并可以逆轉(zhuǎn)黃綠青霉素的細胞毒性。
　　結(jié)論:黃綠青霉素可在HepG2細胞內(nèi)促進自噬小體的形成。在黃綠青霉素的肝臟毒性中，細胞自噬是細胞死亡的主要原因，而黃綠青霉素誘導(dǎo)的自噬性細