黃綠青霉素通過溶酶體-線粒體軸引起HepG2細(xì)胞自噬依賴性凋亡的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:黃綠青霉素（citreoviridin，CIT）是一種真菌毒素，由發(fā)霉谷物中的真菌（主要為黃綠青霉菌）產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，若糧食谷物中的水分達(dá)到14.6％，黃綠青霉菌就開始生長(zhǎng)。因而，當(dāng)儲(chǔ)存環(huán)境潮濕、時(shí)間過長(zhǎng)等不利條件時(shí)，糧食中的黃綠青霉菌就生長(zhǎng)迅速，發(fā)生真菌及其毒素的污染加重。雖然目前糧食的生產(chǎn)、加工、貯藏工藝越來(lái)越科學(xué)，其衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的制定和監(jiān)督機(jī)制的執(zhí)行也愈加嚴(yán)格并不斷完善，但是貯存的糧食仍然遭遇真菌的污染，其發(fā)生情況依然較為嚴(yán)重。

2、目前針對(duì)黃綠青霉素的毒性研究都集中在其心臟血管毒性、遺傳毒性以及神經(jīng)毒性，但是肝臟作為重要的代謝和解毒器官，黃綠青霉素對(duì)肝臟毒性的研究卻并不多見，因而其作用機(jī)制的探究也就更不明確，這也是本試驗(yàn)對(duì)黃綠青霉素毒性機(jī)制探討的關(guān)注點(diǎn)。
　　近年來(lái)，隨著細(xì)胞自噬研究的深入，發(fā)現(xiàn)自噬水平過度上調(diào)則引起細(xì)胞自噬性死亡，被稱為Π型程序性死亡，區(qū)別于Ⅰ型程序性死亡—凋亡。雖然從生化代謝途徑和形態(tài)學(xué)方面來(lái)看，兩者確實(shí)存在著明顯的差別。但是，越來(lái)越多的

3、數(shù)據(jù)表明，它們之間的信號(hào)通路存在著廣泛的交聯(lián)。我們以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果已表明，黃綠青霉素能誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞(HepG2)自噬體形成增多，而本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谔剿髟诒┞队邳S綠青霉素的HepG2細(xì)胞中，自噬與溶酶體膜通透性增加及凋亡之間的關(guān)系。本研究可為探索自噬和凋亡之間的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也可更深入地理解黃綠青霉素肝臟毒性的分子機(jī)制。
　　方法:之前的實(shí)驗(yàn)研究中測(cè)定黃綠青霉素作用于HepG2細(xì)胞的IC50為7.2μM，濃度為5μM時(shí)，HepG2

4、細(xì)胞的存活率可達(dá)到80％。因而本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇黃綠青霉素的濃度為5μM，在不同的時(shí)間點(diǎn)作用于研究對(duì)象—HepG2細(xì)胞。用Western blot（蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)）檢測(cè)經(jīng)黃綠青霉素處理后，HepG2細(xì)胞中LC3（細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)記物-微管相關(guān)蛋白輕鏈3）和cathepsin D蛋白表達(dá)量的變化;用熒光顯微鏡觀察經(jīng)AO染色的HepG2細(xì)胞溶酶體膜穩(wěn)定性變化;用熒光顯微鏡觀察經(jīng)JC-1染色的HepG2細(xì)胞的線粒體膜電位改變情況;用分光光度法

5、檢測(cè)經(jīng)黃綠青霉素處理后，HepG2細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活性變化;用TUNEL染色檢測(cè)經(jīng)黃綠青霉素處理后，HepG2細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。預(yù)先用自噬抑制劑3-MA（3-Methyladenine，3-甲基腺嘌呤）或siRNA Atg5處理后，研究在CIT處理細(xì)胞中，自噬與溶酶體膜穩(wěn)定性和凋亡的相互關(guān)系。用組織蛋白酶D的抑制劑-抑胃肽預(yù)先處理后，研究組織蛋白酶D在CIT所致凋亡中發(fā)揮的作用。
　　結(jié)果:以濃度為5μM的黃綠青霉素處理

6、HepG2細(xì)胞3h、6h、12h、24 h后發(fā)現(xiàn)，在6h時(shí)，細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量與對(duì)照組相比已出現(xiàn)顯著增高，并呈時(shí)間依賴性升高。而在3h時(shí)LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)量與對(duì)照組相比沒有顯著的變化。熒光顯微鏡下觀察到黃綠青霉素處理HepG2細(xì)胞12 h后，溶酶體膜穩(wěn)定性下降，通透性增加，并且溶酶體組織蛋白酶D的表達(dá)量也在12h開始增加，而經(jīng)過自噬抑制劑3-MA和siRNA Atg5干預(yù)后，在12 h時(shí)溶酶體膜通透性增加及組織蛋白酶D的釋放

7、明顯被緩解;熒光顯微鏡下還觀察到黃綠青霉素處理HepG2細(xì)胞12h后，線粒體膜電位開始下降。同樣，經(jīng)過自噬抑制劑3-MA和siRNA Atg5干預(yù)后，CIT所致線粒體膜電位下降有所緩解;分光光度法檢測(cè)Caspase-3活性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)5μM黃綠青霉素處理24 h，HepG2細(xì)胞中的Caspase-3活性升高，而在6h、12h時(shí)Caspase-3的活性與對(duì)照組相比沒有顯著變化。而用自噬抑制劑3-MA、抑胃肽(pepstainA)和siRNA

8、Atg5干預(yù)后，24 h時(shí)Caspase-3的活性明顯降低;TUNEL染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞在CIT處理24 h時(shí)開始發(fā)生凋亡，而在6h、12h則沒有凋亡發(fā)生。用自噬抑制劑3-MA和siRNA Atg5干預(yù)后，CIT所致凋亡得以緩解。
　　結(jié)論:黃綠青霉素可在HepG2細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，且自噬發(fā)生在凋亡之前，CIT誘導(dǎo)的凋亡是自噬依賴性的，CIT通過激活自噬過程，引起溶酶體膜通透性增加，組織蛋白酶D釋放增加，進(jìn)而通過溶酶體-