GP73基因沉默誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞株自噬對(duì)細(xì)胞活力和凋亡的影響.pdf

1、背景：前期研究顯示，在沉默GP73基因的Hep G2細(xì)胞株中存在較高水平的自噬現(xiàn)象，作為一種分子生物學(xué)現(xiàn)象，自噬已經(jīng)被證實(shí)對(duì)多種腫瘤的一系列行為發(fā)揮著重要的影響。
　　目的：在于進(jìn)一步與腫瘤細(xì)胞比較GP73基因沉默細(xì)胞中其誘導(dǎo)所產(chǎn)生自噬的水平，初步探索此種自噬對(duì)于Hep G2細(xì)胞活力和凋亡的影響。
　　方法：設(shè)計(jì)針對(duì)人類GP73基因的小干擾RNA（siRNA），并在Hep G2細(xì)胞株中進(jìn)行沉默其表達(dá)。通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(

2、RT-PCR)在信使 RNA（mRNA）水平和通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）在蛋白質(zhì)水平檢測(cè)沉默效率。使用甲丹磺酰尸胺（MDC）染料和和Beclin1檢測(cè)在一般形態(tài)和定性分析方面確定自噬的水平。同時(shí)聯(lián)合使用3-甲基腺嘌呤(3-MA)抑制劑和雷帕霉素誘導(dǎo)劑，觀察其對(duì)自噬的影響，并進(jìn)一步研究改變后的自噬水平對(duì)于Hep G2細(xì)胞的影響。細(xì)胞活力和凋亡的影響分別通過3,4,5-三羥基苯甲酸二聚體（MTT）實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行觀察和測(cè)定。

3、r>　　結(jié)果：沉默GP73基因后，和空白對(duì)照組比較其mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。MDC染色結(jié)果顯示，沉默后細(xì)胞的熒光密度和MDC標(biāo)記的細(xì)胞數(shù)量均較高，同時(shí)可特異性反應(yīng)自噬水平的Beclin1基因亦較對(duì)照組增高（P<0.05）。而GP73基因沉默后，細(xì)胞增殖受到抑制和誘導(dǎo)凋亡細(xì)胞增多。通過進(jìn)一步聯(lián)合自噬調(diào)節(jié)藥物，結(jié)果顯示3-MA和雷帕霉素均可顯著影響細(xì)胞自噬的水平。其中3-MA抑制了自噬，同時(shí)進(jìn)一步顯著影響了Hep