奧沙利鉑誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株自噬潮的增加及其對(duì)細(xì)胞活力的影響.pdf

1、背景:原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是目前世界上最常見(jiàn)、惡性程度最高的腫瘤之一。在我國(guó)居惡性腫瘤發(fā)病率的第三位,死亡率的第二位。肝切除術(shù)是目前HCC治療中最實(shí)用、最有效的方法。但令人遺憾的是,近80％的患者在確診時(shí)已屬晚期,失去了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)?；瘜W(xué)治療仍是HCC治療,尤其是晚期HCC治療的重要方法。
　　在HCC治療的細(xì)胞毒類(lèi)藥物中,奧沙利鉑(Oxaliplatin,Oxa)是被推崇具有

2、潛在優(yōu)勢(shì)的少數(shù)幾種藥物之一。目前,許多與Oxa相關(guān)的聯(lián)合療法被用于原發(fā)性肝癌的治療,并取得了較好的療效。但是關(guān)于Oxa在進(jìn)展期HCC治療過(guò)程中是否能誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生及其是通過(guò)何途徑誘導(dǎo)自噬的產(chǎn)生都鮮有報(bào)道。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)是一種重要的真核細(xì)胞器,由于各種原因引起的ER中出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以及Ca2+平衡紊亂的狀態(tài),稱為ER應(yīng)激(ER Stress,ERS)。當(dāng)刺激的強(qiáng)度

3、足夠大時(shí),ERS會(huì)引起細(xì)胞死亡,近來(lái)研究表明ERS可以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)除凋亡外的另一種程序化細(xì)胞死亡方式—自噬。自噬是通過(guò)溶酶體清除胞漿物質(zhì)包括長(zhǎng)壽命蛋白和損傷細(xì)胞器的過(guò)程。自噬對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮著極其重要與復(fù)雜的作用,已成為目前腫瘤靶向治療的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)主要探索Oxa能否通過(guò)ERS途徑誘導(dǎo)自噬并在體外影響肝癌細(xì)胞的化療敏感性,以期為肝癌的化學(xué)治療尋找新的策略。
　　目的:探討Oxa誘導(dǎo)的自噬對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG-2活力的影響并

4、初步探討其可能機(jī)制
　　方法:1.細(xì)胞計(jì)數(shù)CCK-8(cell counting kit-8)法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化;
　　2.綠色熒光FITC-LC3-Ⅱ抗體檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)自噬體的分布和數(shù)量;
　　3.透射電子顯微鏡下(TEM)觀察Oxa作用后HepG2細(xì)胞自噬體的形成;
　　4.Western blot檢測(cè)ERS標(biāo)志性蛋白GRP78及凋亡蛋白Caspase-3并觀察自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變。

5、　　結(jié)果:1.CCK-8結(jié)果顯示,Oxa可引起HepG2細(xì)胞死亡并呈現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系,自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)或氯喹(chloroquine,CQ)聯(lián)合作用后與Oxa聯(lián)用時(shí)均能對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用;
　　2.綠色熒光FITC標(biāo)記的自噬特異性蛋白LC3-Ⅱ可以清楚顯示經(jīng)Oxa作用后,有大量綠色熒光小點(diǎn)即自噬小體散在分布于細(xì)胞膜附近,且數(shù)量明顯多于對(duì)照組;
　　3.

6、透射電鏡觀察到Oxa可誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)自噬小體的形成;
　　4.Western blot結(jié)果顯示Oxa可誘導(dǎo)GRP78蛋白及Caspase-3蛋白表的的增加,觀察到經(jīng)Oxa處理后LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)增多,CQ抑制自噬降解通路后LC3-Ⅱ蛋白則明顯增加(自噬潮增加);3-MA則可抑制HepG2細(xì)胞自噬體的形成。
　　結(jié)論:Oxa可能通過(guò)ERS途徑增強(qiáng)人肝癌HepG2細(xì)胞的自噬功能,誘導(dǎo)自噬體形成增加;不同靶點(diǎn)的自噬抑制劑3-