自噬誘導(dǎo)和抑制對(duì)MIN6細(xì)胞株分化的作用初探.pdf

1、目的:
　　糖尿病發(fā)病機(jī)制中有兩個(gè)重要環(huán)節(jié)，就是胰島β細(xì)胞分泌胰島素不足和周圍組織的胰島素抵抗。如何促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)β細(xì)胞再生并抑制β細(xì)胞凋亡是近年研究的熱點(diǎn)。胰島ε細(xì)胞與β細(xì)胞來(lái)源于共同的內(nèi)分泌前體細(xì)胞，通過(guò)內(nèi)源性機(jī)制保持分化的平衡。Ghrelin表達(dá)于ε細(xì)胞，insulin表達(dá)于β細(xì)胞。前期研究已發(fā)現(xiàn)宮內(nèi)營(yíng)養(yǎng)不良新生大鼠胰島存在ε/β細(xì)胞分化失衡，其ε細(xì)胞數(shù)量和分布也與對(duì)照組顯著不同，且上述ε/β細(xì)胞失衡與后期糖尿病

2、風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。因此，明確ε/β分化失衡的機(jī)制有助于調(diào)控β細(xì)胞定向分化和增殖，是從發(fā)育早期干預(yù)和逆轉(zhuǎn)糖尿病進(jìn)程的重要切入點(diǎn)。新近的研究發(fā)現(xiàn)，自噬在調(diào)控ε/β分化、防止β細(xì)胞凋亡、維持β細(xì)胞數(shù)量及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮極其重要的作用。
　　自噬(autophagy)是細(xì)胞內(nèi)形成的雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，包裹所降解的物質(zhì)、大分子或細(xì)胞器，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。自噬相關(guān)蛋

3、白7(autophagy-related protein7，Atg7)是維持成年干細(xì)胞多向分化性的重要調(diào)節(jié)因子;雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的感受器，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)豐富時(shí)，mTOR活化，通過(guò)抑制下游Atg蛋白，抑制自噬的發(fā)生;饑餓狀態(tài)時(shí)mTOR活化被抑制，Atg家族成員活化，促進(jìn)自噬體的形成。mTOR抑制因子及自噬活化因子能夠顯著提高誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞產(chǎn)生的速度和效率

4、;自噬也有助于維持處于分化終點(diǎn)的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。
　　基于以上背景，自噬可能在胰島β細(xì)胞和ε細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)生作用，但具體機(jī)制尚不清楚。本研究擬用小鼠胰島細(xì)胞瘤MIN6細(xì)胞株為模型，在體外培養(yǎng)，通過(guò)抑制或誘導(dǎo)劑調(diào)控自噬信號(hào)，在培養(yǎng)的不同階段加入針對(duì)不同自噬階段抑制劑或誘導(dǎo)劑，觀察其對(duì)MIN6細(xì)胞株表達(dá)定向ghrelin分布和insulin的變化，以此推測(cè)其分化為ε/β細(xì)胞的潛能的變化，希望本結(jié)果可以為探索1型糖尿病的發(fā)生原因奠定基礎(chǔ)。<

5、br>　　方法:
　　利用小鼠胰島素瘤MIN6細(xì)胞株，在培養(yǎng)的不同階段加入針對(duì)不同自噬階段的抑制劑或誘導(dǎo)劑，以PT-PCR、Western blot檢測(cè)其對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞自噬途徑中關(guān)鍵因子LC3、Atg7、LAMP2、p62等表達(dá)的影響，同時(shí)以免疫熒光檢測(cè)MIN6細(xì)胞株表達(dá)ghrelin分布和insulin的變化，來(lái)探討自噬對(duì)胰島ε/β細(xì)胞分化的影響。
　　結(jié)果:
　　1.誘導(dǎo)/抑制自噬過(guò)程中幾種自噬調(diào)控蛋白與效應(yīng)蛋白的mR

6、NA水平及蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，饑餓組細(xì)胞BECLIN1表達(dá)降低(P＜0.05)，Atg7、LAMP-2基因表達(dá)增高，Lc3和P62基因未見(jiàn)明顯改變;3-MA組細(xì)胞中BECLIN基因和Lc3基因表達(dá)降低(P＜0.05)，其余基因未見(jiàn)明顯的改變。Western-blotting對(duì)比檢測(cè)抑制/誘導(dǎo)組與正常對(duì)照組中LC3與p62、LAMP2的水平，相對(duì)于對(duì)照組細(xì)胞，饑餓組細(xì)胞P62蛋白水平堆積(P＜0.05)，Lc3-Ⅱ/Ⅰ表達(dá)降低(P＜0.

7、05);3-MA組細(xì)胞中P62水平未見(jiàn)明顯變化，Lc3-Ⅱ/Ⅰ比例明顯降低(P＜0.05)。LAMP-2蛋白在三組細(xì)胞中的表達(dá)未見(jiàn)明顯變化。
　　2.RT-PCR的結(jié)果同免疫熒光結(jié)果相一致，饑餓組細(xì)胞insulin基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，3-MA組細(xì)胞insulin基因的轉(zhuǎn)錄水平則明顯降低，饑餓組和3-MA組ghrelin基因的轉(zhuǎn)錄水平都顯著降低。
　　3.細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)的免疫熒光結(jié)果顯示，同對(duì)照組細(xì)胞相比，饑餓組細(xì)胞分泌in