三氧化二砷誘導(dǎo)白血病細胞株自噬性死亡及其分子機制研究.pdf

1、國內(nèi)外臨床研究已經(jīng)證實三氧化二砷(Arsenic trioxide,As<,2>C)可有效地治療復(fù)發(fā)和/或初發(fā)的急性早幼粒細胞白血病(Acute Promyelocytic Leukemia,APL),并能達到完全緩解.由于As<,2>O<,3>和化療藥物作用的靶點不同,臨床應(yīng)用時亦沒有明顯的骨髓抑制;且沒有化療藥物的其他嚴重毒副反應(yīng).因此,國內(nèi)外研究人員試圖將As<,2>O<,3>應(yīng)用于其他惡性腫瘤的治療.在血液腫瘤方面,許多體外實驗

2、研究表明:As<,2>O<,3>可誘導(dǎo)髓系、淋巴系和漿細胞等惡性血液病細胞株凋亡.在臨床研究方面,As<,2>O<,3>已經(jīng)進入治療慢性粒細胞性白血病、急性粒細胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤和骨髓增生異常綜合征(MDS)等疾病的臨床Ⅰ期和Ⅱ期研究.但是As<,2>O<,3>治療淋巴細胞白血病的研究報道尚少,其對淋巴細胞惡性腫瘤和MDS的作用機制尚不清楚. 本研究采用MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,

3、5-diphenyltelra-zoliumbromide)比色法觀察As<,2>O<,3>對T細胞白血病細胞株Molt-4和MDS細胞株Mutz-1細胞的生長抑制作用.結(jié)果發(fā)現(xiàn),As<,2>O<,3>可顯著抑制兩種白血病細胞株的生長,并呈時間一劑量依賴性.藥物作用48小時對Molt-4細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為4.68μmol/L,對Mutz-1細胞的IC50為1.79μmol/L.用碘化丙啶(PI)和AnnexinV對As<,

4、2>O<,3>處理的白血病細胞株雙標(biāo)記,流式細胞儀(FACS)檢測結(jié)果顯示Annexin V<'+>、PI<'->細胞(即凋亡細胞)呈劑量依賴性增加,提示As<,2>O<,3>導(dǎo)致了白血病細胞凋亡.同時,FACS分析結(jié)合TUNEL檢測法表明:As<,2>O<,3>誘導(dǎo)的死亡細胞一部分是TUNEL陰性的.熒光顯微鏡下觀察細胞在細胞膜沒有破壞的情況下PI能否染色細胞,結(jié)果顯示:藥物處理48h后,細胞被PI所標(biāo)記,提示藥物處理能夠?qū)е掳籽〖?/p>

5、胞發(fā)生非凋亡形式的死亡.Western-Blot分析結(jié)果顯示:藥物作用Molt.4細胞后,啟動Caspase蛋白,即Caspase-8和Caspase-9被激活,呈時間依賴性;Bid也被激活,提示Caspase-9可能通過Bid的激活而被激活.執(zhí)行Caspase蛋白中,Caspase-7呈時間依賴性激活,而Caspase-3、Caspase-6沒有顯著變化.Caspase抑制劑實驗結(jié)果顯示:Pan-caspase抑制劑能部分抑制As<,

6、2>O<,3>誘導(dǎo)的Molt-4細胞凋亡,而Caspase-3、Caspase-7和Caspase-8抑制劑均不能抑制As<,2>O<,3>誘導(dǎo)的Molt-4細胞死亡.應(yīng)用透射電鏡觀察藥物作用前后白血病細胞的超微結(jié)構(gòu).實驗結(jié)果顯示,藥物作用后,白血病細胞的細胞膜不完整,胞漿中出現(xiàn)大量囊泡.提示As<,2>O<,3>誘導(dǎo)的Molt-4和Mutz-1細胞發(fā)生了自噬性細胞死亡,有別于細胞凋亡.磷脂酰肌醇激酶3(Phosphatidylinos

7、itol 3-kinase,P13K/AKT)通路的抑制劑(3-MA)預(yù)育后再和As<,2>O<,3>共同作用于白血病細胞株(4 μM As<,2>O<,3>作用于Molt-4細胞48 h, 2μM As<,2>O<,3>作用于Mutz-1細胞48 h),流式細胞儀(PI和FSC參數(shù))分析3-MA對As<,2>O<,3>誘導(dǎo)的非凋亡細胞的抑制作用,結(jié)果表明3-MA顯著抑制了非凋亡細胞的產(chǎn)生,同時3-MA顯著增加了細胞凋亡.用Wester

8、n-blot分析結(jié)果顯示用三氧化二砷作用后的Molt-4細胞磷酸化的AKT上調(diào),而用3-MA作用后的磷酸化的AKT下調(diào),進一步證明As<,2>O<,3>誘導(dǎo)了白血病細胞發(fā)生自噬性死亡. 近年來研究發(fā)現(xiàn),自噬性細胞死亡作為非細胞凋亡死亡的一種主要方式在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著十分重要的作用.但目前對血液腫瘤的自噬性細胞死亡及其機制尚不清楚.Jia等報道腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)T淋巴細胞白血病細胞株發(fā)生凋亡前有自體吞噬現(xiàn)象發(fā)生.動物實驗

9、研究表明,Beclin-1-人類Bcl-2相互作用蛋白基因敲除的小鼠容易發(fā)生上皮細胞和血液系統(tǒng)惡性腫瘤.Saeki等報道應(yīng)用Beclin-1反義寡核苷酸處理HL-60細胞導(dǎo)致了自噬性細胞死亡.2003年Kanzawa等的研究表明As<,2>O<,3>可誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤細胞發(fā)生自噬性細胞死亡,但作用機制還不清楚.這些研究和我們的實驗結(jié)果均提示自體吞噬和自噬性細胞死亡在血液腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用,對血液腫瘤細胞的自噬性死亡及其信號途

10、徑研究將有可能為血液腫瘤的治療提供新的靶點.我們應(yīng)用Western-blot和定量實時RT-PCR研究了As<,2>O<,3>對白血病細胞株Beclin-1表達的影響.結(jié)果表明:在蛋白水平,As<,2>O<,3>顯著上調(diào)了白血病細胞株Beclin-1的表達,呈時間和劑量依賴性.而在mRNA水平,As<,2>O<,3>對Beclin-1的表達無影響.用蛋白合成抑制劑(CHX)能顯著抑制As<,2>O<,3>對白血病細胞株Beclin-1表

11、達的上調(diào)作用,提示As203對白血病細胞株Beclin-1表達的影響是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平的;As<,2>O<,3>可能通過使Beclin-1表達增加導(dǎo)致細胞發(fā)生自體吞噬,進一步引起自噬性細胞死亡.由于Bcl-2家族與自體吞噬的發(fā)生有密切關(guān)系,我們進一步研究了As<,2>O<,3>對白血病細胞株Bcl-2家族蛋白表達的影響.結(jié)果表明:藥物作用后,Molt-4細胞Bcl-2蛋白表達明顯下調(diào),呈時間依賴性.Bax蛋白表達呈時間一劑量依賴性下調(diào).

12、而Bak蛋白沒有明顯受到影響.為了了解As203影響Molt-4細胞Bax和Bak表達的機制,我們用定量實時RT-PCR檢測了藥物作用后Bcl-2家族相關(guān)基因mRNA水平的變化;結(jié)果顯示:在mRNA水平,Bax表達和Bak表達沒有受到影響.提示As<,2>O<,3>對Bax的調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平. 綜上所述,我們的研究結(jié)果表明:(1)在臨床有效血藥濃度范圍內(nèi),As<,2>O<,3>顯著抑制Molt-4細胞(2μmol/L-6gm

13、ol/L)和Mutz-1細胞(1 gmol/L-3μmol/L)的增殖;As<,2>O<,3>對這兩種白血病細胞株的生長抑制作用呈時間和劑量依賴性.藥物作用48小時,Molt-4細胞的IC50大于4μmol/L;而藥物作用48小時后Mutz-1細胞的IC50為1.79μmol/L.表明Mutz-1細胞株對三氧化二砷的敏感性高于Molt-4細胞株. (2)As<,2>O<,3>對兩種白血病細胞株有誘導(dǎo)凋亡作用,但也有非凋亡死亡.藥物作用后

14、有Caspase-8和Caspase-9的激活,Bid也被激活,提示Caspase-9可能通過Bid的激活而被激活.執(zhí)行Caspase蛋白中,Caspase-7呈時間依賴性激活,而Caspase-3、Caspase-6沒有顯著變化.Pan-caspase抑制劑能部分抑制三氧化二砷誘導(dǎo)的Molt-4細胞凋亡,而Caspase-3、Caspase-7和Caspase-8抑制劑均不能抑制三氧化二砷誘導(dǎo)的Molt-4細胞死亡.(3)Rhodam

15、in123染色表明,藥物作用后細胞的線粒體膜電位沒有顯著變化;細胞超微結(jié)構(gòu)和磷脂酰肌醇激酶3抑制劑(3-MA)研究結(jié)果顯示As<,2>O<,3>可誘導(dǎo)Molt-4和Mutz-1細胞發(fā)生自噬性細胞死亡.Western blot分析提示As<,2>O<,3>可能通過使Beclin-1蛋白表達增加導(dǎo)致細胞發(fā)生自體吞噬,進一步引起自噬性細胞死亡.(4)As<,2>O<,3>對白血病細胞株Bcl-2家族蛋白表達也有影響.三氧化二砷作用后,Molt