雷帕霉素對(duì)白血病細(xì)胞株抗腫瘤效應(yīng)及其機(jī)制的初步研究.pdf

1、目的：探討雷帕霉素對(duì)白血病細(xì)胞株的生物學(xué)影響及其在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及自噬、抑制腫瘤血管生成等方面存在的可能的抗腫瘤機(jī)制。
　　方法：常規(guī)方法復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)HL-60（人急性早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞株）、K562（人慢性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞株）、SUP-B15（人急性B淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞株）細(xì)胞，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞以不同濃度雷帕霉素（0.1～100nmol/L）處理72h后，采用 MTT法測(cè)定雷帕霉素對(duì)白血病細(xì)胞株增殖的抑制作用，篩選對(duì)雷帕

2、霉素作用敏感的白血病細(xì)胞株；雷帕霉素敏感細(xì)胞株設(shè)置空白對(duì)照組（正常培養(yǎng)）、雷帕霉素處理組（10、20、50、100nmol/L）處理24h、48h、72h后收集細(xì)胞用于檢測(cè)：①倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，常規(guī)瑞氏染色后光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；MTT比色法檢測(cè)不同處理組細(xì)胞的活力和增殖能力的改變；②采用 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；③采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)Bcl-2、Beclin1、HIF-

3、1α、VEGF基因表達(dá)變化；④吖啶橙單染熒光顯微鏡觀察細(xì)胞自噬；⑤透射電鏡觀察亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化。
　　結(jié)果：1. MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雷帕霉素對(duì) HL-60、K562、SUP-B15細(xì)胞 IC50值分別為156.894 nmol/L、157.549nmol/L、18.174nmol/L，相對(duì)于HL-60、K562細(xì)胞，雷帕霉素對(duì)SUP-B15細(xì)胞的抑制作用較強(qiáng)，且該抑制作用隨藥物劑量增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)；2.倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，

4、不同濃度雷帕霉素處理后，SUP-B15細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)量減少，死細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞出現(xiàn)抱團(tuán)生長(zhǎng)、胞膜出泡、細(xì)胞破碎等現(xiàn)象，并隨雷帕霉素濃度升高和作用時(shí)間延長(zhǎng)，變化程度更加明顯。觀察瑞氏染色的各組細(xì)胞，與空白對(duì)照組比較，不同濃度雷帕霉素作用SUP-B15細(xì)胞72h后，細(xì)胞胞漿出現(xiàn)空泡，并隨雷帕霉素濃度升高而增多；3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，不同濃度雷帕霉素作用于SUP-B15細(xì)胞可引起細(xì)胞凋亡增加，48h、72h細(xì)胞凋亡率較24h時(shí)高

5、；雷帕霉素作用48h時(shí)的細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度增大而增多，而72h時(shí)較高劑量藥物（50nmol/L、100nmol/L）引起的細(xì)胞凋亡較低劑量藥物（10nmol/L、20nmol/L）少；4.吖啶橙單染熒光顯微鏡觀察細(xì)胞自噬結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，不同濃度雷帕霉素處理SUP-B15細(xì)胞24h后，可見(jiàn)胞漿中紅色斑點(diǎn)的酸性膜泡（即為自噬小體）增多，且紅色斑點(diǎn)數(shù)量隨藥物濃度增大和作用時(shí)間延長(zhǎng)而增多；5.透射電鏡觀察結(jié)果顯示，經(jīng)雷帕霉素處理的

6、SUP-B15細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)較多自噬小體和自噬溶酶體，線粒體內(nèi)嵴明顯紊亂，細(xì)胞核不規(guī)則；6.與各時(shí)間段對(duì)照組相比，不同濃度雷帕霉素處理SUP-B15細(xì)胞24h、48h、72h后，均可上調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)（P<0.05），且隨時(shí)間延長(zhǎng)，上調(diào)作用更加明顯；作用48h、72h時(shí)，與其它濃度相比，20nmol/L雷帕霉素處理組對(duì)Bcl-2基因表達(dá)的上調(diào)最明顯（P<0.05）；7.與各時(shí)間段對(duì)照組相比，不同濃度雷帕霉素處理SUP-B15細(xì)胞可

7、顯著上調(diào)Beclin1基因的表達(dá)（P<0.05），在100nmol/L雷帕霉素作用72h后，該上調(diào)表達(dá)的作用最強(qiáng)；8.不同濃度雷帕霉素作用SUP-B15細(xì)胞24h后，對(duì)HIF-1α表達(dá)變化不明顯；48h時(shí)，10nmol/L和100nmol/L雷帕霉素對(duì) HIF-1α表達(dá)調(diào)控呈上調(diào)趨勢(shì)，而20nmol/L、50nmol/L雷帕霉素則下調(diào)HIF-1α基因的表達(dá)；72h時(shí)，不同濃度雷帕霉素可小幅上調(diào)HIF-1α基因的表達(dá)；9.不同濃度雷帕霉素

8、作用SUP-B15細(xì)胞24h、48h后，均可顯著下調(diào)VEGF基因的表達(dá)（P<0.05），且在24h時(shí)下調(diào)最明顯；72h時(shí)，10nmol/L、20nmol/L雷帕霉素上調(diào)VEGF基因的表達(dá)，50nmol/L、100nmol/L雷帕霉素則下調(diào)VEGF基因的表達(dá)。
　　結(jié)論：1.雷帕霉素對(duì)SUP-B15細(xì)胞生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用，且呈劑量-時(shí)間依賴性；2.雷帕霉素可誘導(dǎo)SUP-B15細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡，且自噬的發(fā)生先于凋亡出現(xiàn)，一定強(qiáng)度的