鼻咽癌腫瘤干細(xì)胞mTOR通路的激活及雷帕霉素的抗腫瘤效應(yīng).pdf

1、目的:
　　通過檢測鼻咽癌組織、細(xì)胞中mTOR(mammalian target of rapamycin)信號通路蛋白及腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記CD133、SOX2和OCT4的表達(dá)，探討mTOR信號通路在鼻咽癌細(xì)胞中是否激活及鼻咽癌中是否存有腫瘤干細(xì)胞。進(jìn)一步檢測鼻咽癌中的腫瘤干細(xì)胞mTOR通路是否激活。再用mTOR通路抑制劑雷帕霉素探測其對體外、體內(nèi)移植的鼻咽癌細(xì)胞及干細(xì)胞的生長增殖是否抑制，及其對mTOR通路活性蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。<

2、br>　　方法:
　　1.免疫組織化學(xué)檢測鼻咽癌組織、細(xì)胞中及裸鼠移植腫瘤組織中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記CD133、多潛能干細(xì)胞標(biāo)記SOX2和OCT4及mTOR信號通路中四種代表蛋白mTOR、S6、pmTOR和pS6的表達(dá)情況。其中pS6和pmTOR是mTOR信號通路的活化形式。
　　2.免疫熒光雙染色法檢測鼻咽癌細(xì)胞及裸鼠移植腫瘤組織中mTOR信號通路蛋白與CD133、SOX2共表達(dá)情況。
　　3.用CCK8對預(yù)先用不同濃度雷

3、帕霉素處理和溶劑對照處理48和72小時(shí)后的原代鼻咽癌細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行檢測。
　　4.將原代培養(yǎng)的第15代鼻咽癌細(xì)胞注入裸鼠體內(nèi)使成瘤，同時(shí)腹腔注射雷帕霉素處理和對照溶劑14天，檢測裸鼠腫瘤生長情況及大小質(zhì)量。
　　5.Western blot技術(shù)檢測預(yù)先用不同濃度雷帕霉素處理和溶劑對照處理48小時(shí)后的原代鼻咽癌細(xì)胞及裸鼠移植腫瘤組織中mTOR信號通路中蛋白S6、4E-BP1、mTOR、pS6、pmTOR和p4E-BP1的相

4、對表達(dá)量。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示。組織中免疫組化陽性表達(dá)率采用非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，不同濃度雷帕霉素抑制細(xì)胞生長采用One-way ANOVA方差分析，多重比較采用LSD法，裸鼠移植瘤大小、質(zhì)量比較及移植瘤組織中對照與藥物組之間蛋白相對表達(dá)量用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.鼻咽癌組織中腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記CD133、多潛能干細(xì)胞標(biāo)記SOX2和O

5、CT4的表達(dá)比鼻咽炎組織高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;鼻咽癌細(xì)胞中及裸鼠移植腫瘤組織中CD133、SOX2、OCT4及mTOR、S6、pmTOR和pS6呈陽性表達(dá)。
　　2.免疫熒光雙染色顯示鼻咽癌細(xì)胞及裸鼠移植腫瘤組織中mTOR信號通路蛋白與CD133、SOX2共表達(dá)。
　　3.用雷帕霉素濃度分別為0、10、20、30、40、50、100nmol/L處理的原代鼻咽癌細(xì)胞48和72小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度的加大，相應(yīng)的癌細(xì)胞生存率依次下

6、降;而相同濃度雷帕霉素72小時(shí)處理過的癌細(xì)胞比處理48小時(shí)的生存率要低。
　　4.裸鼠移植瘤，相對于溶劑對照組，雷帕霉素處理組腫瘤大小、質(zhì)量受抑制有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.Western blot檢測光密度結(jié)果顯示，當(dāng)雷帕霉素濃度分別為0，30，50，100nmol/L時(shí)，隨著藥物濃度的增加，活性形式的pmTOR蛋白的表達(dá)量逐漸下降，而pS6雷帕霉素處理后未能檢出。相對于溶劑對照組，雷帕霉素處理組的移植瘤大小和質(zhì)量減小及蛋白p

7、mTOR和p4E-BP1表達(dá)下降都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1.鼻咽癌組織中CD133、SOX2、OCT4、mTOR、S6、pmTOR和pS6呈陽性表達(dá)，說明mTOR信號通路在人類原發(fā)鼻咽癌中被激活，且鼻咽癌組織中有腫瘤干細(xì)胞。免疫熒光雙染色法檢測鼻咽癌細(xì)胞及裸鼠移植腫瘤組織中mTOR信號通路蛋白與CD133、SOX2共表達(dá)，說明腫瘤干細(xì)胞中mTOR信號通路被激活。
　　2.Western blot檢測結(jié)果顯示，

8、體外實(shí)驗(yàn)中雷帕霉素能夠下調(diào)鼻咽癌細(xì)胞中pS6、pmTOR蛋白的表達(dá)，而且該作用在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　3.CCK8檢測不同濃度雷帕霉素處理48h和72小時(shí)后細(xì)胞的存活情況，結(jié)果說明在一定范圍內(nèi)，鼻咽癌細(xì)胞增殖受雷帕霉素抑制有濃度和時(shí)間依賴性。
　　4.體內(nèi)實(shí)驗(yàn)說明雷帕霉素不僅能抑制mTOR信號通路，而且可以抑制腫瘤的生長和增殖。
　　5.由此推斷，mTOR信號通路在人類鼻咽癌干細(xì)胞中被激活，而且在生長、增殖過