鼻咽癌腫瘤抗原的血清學篩選及表達研究.pdf

1、腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展過程中，惡變的細胞胞內信號傳導通路改變、基因表達異常、代謝異常，導致腫瘤細胞的惡性增殖。以往的研究發(fā)現(xiàn)健康人和腫瘤患者體內均存在對腫瘤特異性抗原反應的T細胞前體；在對腫瘤患者的長期追蹤中發(fā)現(xiàn)，部分腫瘤患者經(jīng)適當腫瘤抗原肽疫苗免疫后，可以根除體內腫瘤細胞而長期存活。這些結果表明，采用適當?shù)拿庖吒深A手段，可以達到根除體內腫瘤細胞的目的。然而，無論是腫瘤主動免疫治療還是被動免疫治療，前提是必須首先獲得腫瘤抗原，腫瘤抗原的尋找一

2、直是腫瘤免疫學研究中面臨的重要課題。鼻咽癌在我國發(fā)病率較高，在頭頸部的惡性腫瘤中鼻咽癌的發(fā)病率居首位，以發(fā)現(xiàn)晚和預后差為特征。對鼻咽癌的病因學研究表明，其發(fā)生是一個多因素、多階段的過程。目前，鼻咽癌的治療以放療為主，配合全身化療等治療，雖然我們的治療手段和方法在不斷提高和改進，但仍有一部分患者預后較差。以往研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌腫瘤細胞周圍總有大量的淋巴細胞浸潤，顯示出很強的免疫原性，說明免疫系統(tǒng)在抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著一定的作用。因此，

3、分離和克隆具有較強免疫原性的鼻咽癌腫瘤抗原對腫瘤的早期診斷與預后判斷以及腫瘤的免疫治療有著十分重要的理論和實際意義。 為了篩選克隆鼻咽癌特異/相關抗原，四川大學華西醫(yī)院人類疾病腫瘤生物治療實驗室自行構建了鼻咽癌cDNA表達文庫，并應用鼻咽癌患者的混合血清通過血清學篩選重組cDNA表達文庫(SerologicalAnalysisofReecombinantcDNAExpressionLibraries，SEREX)對其腫瘤抗原進行

4、初步篩選，獲得了幾種與已知基因具有同源性的抗原基因。 本研究繼續(xù)利用SEREX技術篩選鼻咽癌cDNA表達文庫，以求尋找腫瘤特異/相關性抗原基因。所不同的是，在篩選過程中，根據(jù)異種同源基因在進化過程中所形成的細微差別來打破免疫耐受、增強免疫原性、誘導產(chǎn)生較強的免疫反應，我們嘗試用鼻咽癌細胞株培養(yǎng)的細胞對兔進行靜脈注射而使之產(chǎn)生抗癌細胞抗體，經(jīng)檢測我們獲得了高抗體滴度的異種免疫血清。應用這種高抗體滴度的異種(兔)免疫血清，對鼻咽癌c

5、DNA文庫進行篩選，陽性克隆產(chǎn)生了較強的免疫反應，相對較易篩選到陽性結果。 SEREX包括鋪密度為2500-3000pfu/180mm的噬菌體平板，以1：1500稀釋用大腸桿菌Ecolilysate進行吸附過的兔免疫血清進行篩選。通過篩選1.0×106的噬菌體克隆。經(jīng)過三次復篩后，得到18個陽性克隆，分別命名為NPC-1～18。將陽性克隆進行內部剪切，提取質粒，并應用EcoRI和Xhol進行酶切確定插入片斷長度，酶切結果顯示它們

6、基因片斷的長度從0.3kb-3kb不等。通過對其進行核苷酸測序，對所得到的18個獨立的陽性克隆的序列遞交至Genebank進行同源性比較，用BlastProgram在nr,est，unigene和chromosome中查詢，分析該序列所包含的生物信息。經(jīng)序列分析這些陽性克?。喝筷栃钥寺〉腸DNA序列與人基因組序列的相似性均大于95％，9個序列與已知蛋白或基因有較高的相似性，在人的Genebank中檢索到了同源基因，其中包括MAGE基因

7、、CREM基因、β2-微球蛋白以及核糖體蛋白等已知基因或EST。在已知基因中，結構基因和調節(jié)基因在其中所占的比重較大，說明細胞的結構基因和調節(jié)基因在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中可能具有特殊的地位。這些基因表達的變化，改變了腫瘤細胞的免疫原性，使其成為B細胞識別的靶抗原。另外有6個基因或EST在GenBank數(shù)據(jù)庫中沒有同源性，可能是新基因或EST。提取正常組織、腫瘤組織及癌細胞株的RNA，根據(jù)核苷酸測序結果設計引物，經(jīng)過RT-PCR檢測未知基因N

8、PC-14、NPC-15、NPC-18在不同組織中的mRNA表達。結果顯示NPC-15在各種組織細胞中廣泛表達，NPC-18在腫瘤組織或細胞株中的表達較正常組織上調，而NPC-14則為限制性表達，在我們檢測的正常組織中不表達，僅在某些腫瘤細胞株及腫瘤組織中表達，因而這一基因產(chǎn)物可能屬于CT抗原家族。同時我們應用Westernblot和SEREX二次篩選對NPC-14、NPC-15和NPC-18克隆的表達蛋白進行鼻咽癌患者(40例)及正常

9、人群(40例)血清的抗體檢測，結果顯示在鼻咽癌患者血清中抗NPC-14和NPC-18的抗體陽性率明顯高于正常人群(P＜0.01)。說明該基因片段所表達蛋白可以被免疫系統(tǒng)識別，產(chǎn)生抗原抗體反應，可能是一種具有免疫原性的功能基因。而在鼻咽癌患者血清中抗NPC-15的抗體陽性率與正常人相比無顯著性差別，可能是一種結構蛋白基因產(chǎn)物。同時在血清學檢測過程中發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌個體血清中的抗體陽性表達率均相對較低，這可能是由于免疫系統(tǒng)在早期發(fā)揮免疫作用的同