肝癌組織cDNA文庫的構(gòu)建及肝癌腫瘤抗原基因的篩選.pdf

1、目的：應(yīng)用肝癌患者血清，從人肝癌組織構(gòu)建的cDNA表達(dá)文庫中克隆新的肝癌抗原基因，為尋找和鑒定新的腫瘤抗原探索一條新途徑。 方法：從人肝癌組織中抽提總RNA后磁珠法分離mRNA，以純化的mRNA為模板，以含sfiⅠ酶切位點(diǎn)的oligo(dT)引物合成cDNA的第一鏈，利用SMART(Switching Mechanism At 5′ end of RNA Transcript)技術(shù)，經(jīng)LD-PCR合成雙鏈cDNA，該產(chǎn)物經(jīng)蛋白酶

2、K消化，sfiⅠ酶切后經(jīng)Chroma spin-400柱分級分離，插入片段與λ TripIEx2載體連接經(jīng)體外包裝成噬菌體cDNA文庫。測定原始文庫的滴度，進(jìn)行藍(lán)白篩選以確定文庫重組率，并隨機(jī)挑選克隆經(jīng)PCR擴(kuò)增鑒定插入片段的大小。最后將文庫進(jìn)行擴(kuò)增并鑒定庫容量。用人肝癌患者血清對肝癌組織cDNA文庫進(jìn)行免疫學(xué)篩選，陽性克隆經(jīng)PCR檢測鑒定后進(jìn)行序列分析。 結(jié)果：測定原始文庫滴度為6.9x 106pfu/ml，重組率為97.6％

3、。原始文庫擴(kuò)增后，測定文庫滴度為1.7×109pfu/ml，隨機(jī)挑取45個克隆經(jīng)PCR法鑒定插入片段的大小，插入片段介于0.5-2.0kb之間，平均長度為1.3kb。文庫經(jīng)三輪篩選后共獲得7個陽性克隆，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測序分析及相關(guān)數(shù)據(jù)庫比對，分別代表了7個cDNA插入片段(抗原基因)。其中5個與已知基因高度同源，另外2個基因與GenBank中已知基因部分同源，其中有2個可能是新基因。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了人肝癌組織的cDN