人上皮性卵巢癌組織cDNA表達文庫的構(gòu)建及相關(guān)抗原基因的篩選.pdf

1、目的和意義：卵巢癌是臨床常見的婦科惡性腫瘤，以起病隱匿和預(yù)后差為特征?，F(xiàn)有的腫瘤標(biāo)志物缺乏良好的特異性和敏感性，很難對上皮性卵巢癌做出早期診斷。由于早期發(fā)現(xiàn)困難，而且易發(fā)生多途徑、多部位的轉(zhuǎn)移，故臨床治療效果多不理想，5年存活率較低。因此，尋找一種新的、敏感而特異的腫瘤標(biāo)志物已成為婦科腫瘤學(xué)界研究的熱點。 腫瘤抗原在本質(zhì)上是腫瘤細胞在癌變和惡性生長過程中產(chǎn)生的新的抗原性物質(zhì)。這些物質(zhì)有些是正常細胞基因組中某些基因的突變產(chǎn)物，有些

2、則是正常細胞不表達的沉默基因的產(chǎn)物，另外還有些物質(zhì)在正常組織低表達而在腫瘤組織高表達。低表達時免疫原性弱，不能刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，而高表達時則可誘導(dǎo)產(chǎn)生致敏淋巴細胞和/或形成抗體。因此尋找和發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌的腫瘤特異性抗原和/或相關(guān)抗原，將其作為腫瘤標(biāo)志物，用于早期診斷和治療具有十分重要的理論和實際意義。 本研究擬通過構(gòu)建人上皮性卵巢癌組織cDNA表達文庫，利用SEREX技術(shù)篩選文庫，來尋找卵巢癌相關(guān)抗原，以期獲得中國人卵巢癌

3、相關(guān)抗原分子，為卵巢癌早期診斷和治療奠定基礎(chǔ)。 材料和方法：采用初診卵巢癌患者新鮮癌組織，抽提總RNA，分離純化mRNA，并以此為模板合成第一鏈cDNA，用置換法合成第二鏈cDNA。雙鏈cDNA經(jīng)末端削平、EcoRⅠ接頭連接、XhoⅠ酶切、過柱分級分離，除去〈400bp片段。收集符合需要的cDNA片段與噬菌體ZAPExpress載體連接，經(jīng)體外包裝獲得人卵巢癌組織cDNA表達文庫。測定原始文庫滴度，進行藍白斑篩選以確定文庫的重組

4、率。原始文庫不穩(wěn)定，立即進行擴增，用同法測定擴增文庫滴度。隨機挑取克隆經(jīng)PCR擴增鑒定插入片段大小。然后應(yīng)用SEREX技術(shù)篩選所構(gòu)建的卵巢癌組織cDNA表達文庫。首先抽取同一患者的外周靜脈血分離血清，經(jīng)細菌XLl-Blue裂解物預(yù)吸收處理后，與吸附有噬菌斑的NC膜共孵育，洗滌后，NC膜再與羊抗人IgG抗體結(jié)合，最后用DAB顯色，確定有免疫反應(yīng)的克隆。同法繼續(xù)進行第二輪篩選和第三輪篩選，直至得到一致的免疫陽性重組噬菌體。陽性克隆進行測序、

5、生物學(xué)信息分析。 結(jié)果：經(jīng)檢測原始文庫滴度為5.5×106pfu/ml，擴增后文庫滴度為3.0×1011pfu/ml，重組率96％。cDNA插入片段平均大小在1.0kb以上。文庫經(jīng)三輪血清學(xué)篩選共獲得6個陽性克隆，經(jīng)測序分析及與相關(guān)數(shù)據(jù)庫比對，代表了2個獨立的cDNA片段(抗原基因)。它們分別是細胞外基質(zhì)蛋白1(extracellularmatrixprotein1，ECM1)和富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secretedpro

6、teinacidicandrichincystein，SPARC) 結(jié)論：本實驗所構(gòu)建的人上皮性卵巢癌組織cDNA表達文庫質(zhì)量合格，為以后篩選獲取卵巢癌相關(guān)抗原基因奠定了基礎(chǔ)。應(yīng)用SERER技術(shù)初步篩選卵巢癌組織cDNA文庫，得到2個卵巢癌相關(guān)抗原基因，分別是ECM1和SPARC。現(xiàn)有的文獻資料表明它們與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在卵巢癌研究領(lǐng)域，ECM1表達與卵巢癌的相關(guān)性尚未見報道，SPRAC在卵巢癌有表達，但程度高低存在爭