Poly I：C誘導(dǎo)草魚cDNA表達(dá)文庫的構(gòu)建.pdf

1、隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖模式的不斷改革，與此而來的魚類病害問題也日益突出和嚴(yán)重，尤其是由病毒引起的大規(guī)模暴發(fā)性傳染病更是給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來了沉重的打擊，每年由此造成的損失非常驚人，嚴(yán)重危害了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。干擾素具有廣譜的抗病毒作用，在治療一些人類病毒病時(shí)取得了良好的效果。實(shí)踐證明運(yùn)用體外表達(dá)的重組干擾素不會(huì)對宿主和環(huán)境產(chǎn)生危害，因此利用廣譜的抗病基因進(jìn)行魚類疾病防治可能最有發(fā)展前途。 自20世紀(jì)70年代中期首

2、例cDNA克隆問世以來，構(gòu)建cDNA文庫已成為研究功能基因組學(xué)的基本手段之一?？梢詮腸DNA文庫中篩選到所需的目的基因，并直接用于該目的基因的表達(dá)。通過構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫不僅可保護(hù)瀕危珍惜生物資源，而且可以提供構(gòu)建分子標(biāo)記連鎖圖譜的所用探針，更重要的是可以用于分離全長基因進(jìn)而開展基因功能研究。因此，cDNA在研究具體某類特定細(xì)胞中基因組的表達(dá)狀態(tài)及表達(dá)基因的功能鑒定方便具有特殊的優(yōu)勢，從而使它在個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞衰

3、老和死亡：調(diào)控等生命現(xiàn)象的研究中具有更為廣泛的應(yīng)用價(jià)值，是研究工作中最常使用到的基因文庫。 構(gòu)建誘導(dǎo)后的草魚cDNA文庫，可以大量獲得免疫基因，對于研究草魚的非特異性免疫和與之相關(guān)的干擾素系統(tǒng)有很大的幫助。 方法：用Poly I:C注射草魚，誘導(dǎo)其表達(dá)大量的免疫基因。然后提取RNA，用加了HA接頭的Oligo(dT)做引物，引導(dǎo)cDNA第一鏈的合成，并在加完雙鏈EcoR I接頭后進(jìn)行cDNA雙鏈的PCR擴(kuò)增，得到了cDN

4、A PCR Library。然后將加了EcoR I接頭的cDNA連接到用EcDR I內(nèi)切酶處理過的質(zhì)粒載體里，構(gòu)建了PolyI：C誘導(dǎo)后的草魚cDNA文庫。隨后設(shè)計(jì)引物在該文庫中對Zα cDNA片段和干擾素cDNA進(jìn)行篩選。 結(jié)果：構(gòu)建的cDNA PCR Library的大小平均在1.5kb左右，達(dá)到建庫的基本要求，而且經(jīng)免疫基因檢驗(yàn)完整性較好?？寺〉玫降腪α cDNA片段大小在480bp左右，與CaPKR-like基因進(jìn)行比對