β—萘黃酮誘導(dǎo)劍尾魚肝臟cDNA文庫的構(gòu)建及分析.pdf

1、當(dāng)今，水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物開發(fā)和研究備受世界各國的重視，預(yù)示著水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)又進(jìn)入了一個(gè)新的發(fā)展階段。我國標(biāo)準(zhǔn)水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的開發(fā)研究起步較國外晚，經(jīng)過近十多年的努力，在劍尾魚、稀有鮈鯽和紅鯽的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究方面取得了可喜的成績。 劍尾魚原產(chǎn)地為墨西哥及危地馬拉，1987年，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所開始了劍尾魚的定向培養(yǎng)和相關(guān)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究工作。到目前為止，劍尾魚已經(jīng)被應(yīng)用到水環(huán)境監(jiān)測、水產(chǎn)藥物安全評(píng)價(jià)、動(dòng)物疾病模型等方面。由

2、于近交劍尾魚的遺傳均一性較高，加上飼養(yǎng)過程的營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化和管理規(guī)范化，作為一種標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)材料，保障了不同個(gè)體在應(yīng)用中的反應(yīng)一致性和實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性，從而提高研究的總體水平。但是劍尾魚的已知EST序列還相對較少，許多功能基因以及可以在水環(huán)境監(jiān)測中應(yīng)用的基因數(shù)量更是有限，限制了劍尾魚的應(yīng)用。 本研究以暴露于β—萘黃酮(beta-Naphthoflavone，β-NF)中的劍尾魚(Xiphophorushelleri)為研究對象，采用S

3、MARTTM(Switching Mechanism At5’end of RNA Transcript)技術(shù)，成功構(gòu)建了劍尾魚肝臟cDNA文庫。用SV Total RNA Isolation System試劑盒提取mRNA后，以逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，然后通過LD-PCR合成并擴(kuò)增ds cDNA。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、酶切、過CHROMASPIN-400TM柱去除小片段后，連接到

4、SfiI消化過的pDNR-LIB質(zhì)粒栽體中，最后用電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α內(nèi)得到原始文庫，擴(kuò)增后的文庫保存在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。經(jīng)測定該文庫約含有4.2×107個(gè)重組子，重組效率達(dá)99％，插入片段多在0.6～2.5 kb之間，平均插入片段長度約1.3kb，擴(kuò)增后文庫滴度為7.0×109CFU/mL。隨機(jī)挑取1000個(gè)重組子進(jìn)行測序檢驗(yàn)，共得到長度大于500bp的Expression sequence tag(EST