南方根結(jié)線蟲誘導(dǎo)葡萄早期抗性表達(dá)相關(guān)基因的cDNA文庫構(gòu)建及初步分析.pdf

1、根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)病是葡萄根部主要病害之一，每年造成葡萄的大量損失，并隨著葡萄栽培面積的增加，造成的危害程度越來越大。目前，在葡萄生產(chǎn)上，防治根結(jié)線蟲的主要手段包括農(nóng)藥防治、抗性種質(zhì)材料的篩選利用以及葡萄抗線蟲育種。由于葡萄是多年生果樹種類，研究葡萄抗根結(jié)線蟲抗性機制是一項難度極大的工作，因此，葡萄抗根結(jié)線蟲的主要研究領(lǐng)域集中在抗性種質(zhì)材料的篩選上，對于葡萄抗性材料的抗根結(jié)線蟲的機制及葡萄抗根結(jié)線蟲的早期抗性相關(guān)

2、基因表達(dá)，研究較少。基于此，開展了葡萄抗根結(jié)線蟲的種質(zhì)篩選和抗性相關(guān)基因的cDNA文庫構(gòu)建研究。
　　 本研究主要利用我國原產(chǎn)的葡萄野生資源、生產(chǎn)上常用的葡萄品種、砧木品種以及山歐雜種等38份資源，進行葡萄資源抗根結(jié)線蟲的鑒定，并規(guī)范了葡萄抗根結(jié)線蟲的鑒定方法，篩選出部分對根結(jié)線蟲免疫或高抗的葡萄資源。利用篩選出的葡萄抗性材料“抗砧3號”和高感葡萄品種“維多利亞”為試材，重點進行葡萄在南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneinco

3、gnita)接種后的早期抗病反應(yīng)和感病反應(yīng)，選擇最佳的根結(jié)線蟲侵入時間，利用篩選出的高抗南方根結(jié)線蟲的材料“抗砧3號”進行接種觀察，并通過抑制性消減雜交技術(shù)(SuppressionSubtractiveHybridization，SSH)分析葡萄抗南方根結(jié)線蟲機制及誘導(dǎo)相關(guān)基因的早期表達(dá)，構(gòu)建南方根結(jié)線蟲誘導(dǎo)葡萄早期抗性相關(guān)基因的cDNA文庫并進行部分抗性相關(guān)基因的鑒定及初步分析。
　　 利用形態(tài)學(xué)和rDNA-ITS-PCR方法

4、，對根結(jié)線蟲進行了種類鑒定，鑒定結(jié)果表明，采自6個取樣點的根結(jié)線蟲種類為南方根結(jié)線蟲(M.incognita)。
　　 對供試的38份葡萄資源，對南方根結(jié)線蟲的抗性進行了鑒定，篩選出一批抗性材料，建立了完善的葡萄抗性鑒定評價體系。鑒定結(jié)果如下：(1)原產(chǎn)我國的野生資源抗線蟲性：原產(chǎn)我國的葡萄野生資源，沒有發(fā)現(xiàn)免疫類型，從供試的10個種對根結(jié)線蟲的抗性劃分為四個類型，第一類為高抗資源(HR)，分別為華東葡萄和毛葡萄；第二類為中抗資

5、源(MH)，分別為復(fù)葉葡萄、刺葡萄、蘡薁和華北葡萄；第三類為中感(MS)資源，分別為燕山葡萄、山葡萄和葛藟；第四類為高感(HS)資源，小果野葡萄。(2)栽培品種的抗線蟲性：從供試的4個主要栽培的品種來看，目前我國葡萄產(chǎn)區(qū)主栽品種均不抗葡萄根結(jié)線蟲。但存在抗根結(jié)線蟲的階段性差異，歐美雜種的抗線蟲性強于歐亞種的栽培品種。(3)葡萄砧木品種的抗線蟲性：第一類，砧木品種表現(xiàn)為免疫或極抗。有四個：3309P、Champini、DogRidge、R

6、iparia580。第二類，表現(xiàn)為高抗。有GrandGlaber、5BB、5C、Barrett50、Pulliat、Freedom、抗砧3號。第三類，表現(xiàn)為中等抗性。有貝達(dá)、SO4。第四類，表現(xiàn)為中等感染。有SaltCreek、Gloire、Eldorado、Rupestris2、華佳8號。第五類，表現(xiàn)為感染。有Eldorado、Macadams、1613C。(4)山歐雜種的抗線蟲性：4份山歐雜種均不抗葡萄根結(jié)線蟲，但山歐雜種的抗線蟲能

7、力存在差異，抗性能力的高低與歐亞種的對后代遺傳力有密切關(guān)系。
　　 通過抑制性消減雜交構(gòu)建了南方根結(jié)線蟲誘導(dǎo)的葡萄早期抗性相關(guān)基因cDNA文庫和早期表達(dá)EST譜，共獲得496條EST序列。利用同源性比對軟件進行基因分類和功能注釋共有406條可以找到已知的同源序列，占全部Unigene的92.3％，功能未知的ESTs占7.7％。主要包括代謝、防御、脅迫、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、核糖體蛋白、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞發(fā)育、能量、滲透調(diào)節(jié)以及蛋白質(zhì)合成與分解等

8、10類。這些與抗病相關(guān)的同源序列涉及到與防御、次生代謝、脅迫及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的基因，表明當(dāng)根結(jié)線蟲侵染葡萄根尖后，植物體內(nèi)發(fā)生了一系列的反應(yīng)，抗根結(jié)線蟲反應(yīng)是一個多途徑作用的復(fù)雜過程。
　　 通過GeneOntology(GO)方法對所得基因在分子功能、細(xì)胞組成及生物過程三個方面進行功能分類和分析，發(fā)現(xiàn)葡萄早期抗線蟲作用中與生物過程相關(guān)的基因大量的表達(dá)，刺激反應(yīng)、生物調(diào)節(jié)反應(yīng)、細(xì)胞代謝等方面加強，表達(dá)的基因功能主要以分子綁定、活性

9、調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等為主。初步推斷了葡萄抗南方根結(jié)線蟲的早期表達(dá)涉及病原物的識別、抗性信號傳導(dǎo)、過敏性壞死、系統(tǒng)獲得性抗性以及植物細(xì)胞保護機制等多個方面。
　　 通過EST功能分類，分離出了2個具有編碼具有NBS-LRR結(jié)構(gòu)的抗根結(jié)線蟲蛋白和類LRR抗性蛋白的ESI、序列，分別為：FH1-175和FH1-208，功能分析(BLAST)結(jié)果表明兩個基因與過敏性壞死反應(yīng)(HR)和系統(tǒng)獲得性(SAR)抗性相關(guān)。其他分離得到的8個EST、序