草魚cDNA文庫的構建及CC趨化因子基因的特征分析.pdf

1、CC趨化因子（CC Chemokine）是一類能夠促進動物體內炎癥部位的各種白細胞的補充、激活和黏附的趨化性細胞因子家族，是魚類天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分。趨化因子也是當今國際魚類分子免疫學研究的熱點之一。趨化因子的研究將有助于更好地了解魚類抗病性與天然免疫性的關系。 本文以草魚為研究對象，通過構建草魚cDNA文庫，在草魚腸道和鰓cDNA文庫中篩選到2個草魚CC趨化因子基因，將其命名為CCL24和CCL5，并對這兩個基因在草魚各

2、組織中的表達情況進行分析，為了解草魚的先天免疫系統(tǒng)奠定了一定的基礎。 采用飽和雜交法成功構建了草魚腸道、鰓和肝胰臟的均一化cDNA文庫。隨機測序得到7374個EST序列，去除插入片段小于100bp和空載體得到6370個序列。4964個非重復的基因序列中，2781個為GenBank已知的基因序列，2183個是未知的新基因序列。2781個已知基因序列中，沒有冗余的有2105個，占基因總數(shù)的74．69％，2～5倍冗余的有646個基因，

3、約占總數(shù)的23．23％，大于5倍冗余的基因數(shù)目為30個，占總數(shù)的1．08％。4964個不同基因中551個存在微衛(wèi)星序列，261個為已知基因序列，290個為未知的新基因序列。這些研究結果，為積累草魚遺傳方面的基礎信息，了解草魚腸道、鰓和肝胰臟組織的基因表達提供了較好的研究基礎。 在草魚腸道和鰓的cDNA文庫中各篩選到一個CC趨化因子基因，GenBank比對結果顯示，腸道中篩選的與斑馬魚CCL24基因相似性最高（76％），將其命名為

4、草魚CC趨化因子CCL24；鰓中篩選的與斑馬魚CCL5基因相似性最高（77％），將其命名為草魚CC趨化因子CCL5。草魚CCL24基因cDNA全長為1059bp，編碼95個氨基酸；草魚CCL5基因cDNA全長為895bp，編碼119個氨基酸。用生物信息學的方法分別對上述的2個CC趨化因子基因分析。CCL24蛋白分子量為10370．399Da，等電點為8．39； CCL5分子量為13320．981Da，等電點為9．155。CCL24和CC

5、L5在氨基端都存在大量的疏水性殘基，而羧基末端則有較多的親水性殘基，二者的抗原決定簇分析結果顯示CCL24與CCL5均具有很強的抗原性。CCL24和CCL5在2個相鄰的半胱氨酸殘基之前均具信號肽，CCL24最大可能的信號肽剪切位點位于第22位與第23位氨基酸殘基之間（TDA-VA），CCL5最大可能的信號肽剪切位點位于第27位與第28位氨基酸殘基之間（AEA-QA）。CCL24與CCL5均具膜內側向膜外側和膜外側向膜內側的跨膜結構各一個

6、。CCL5具有典型的Small cytokines（intercrine/chemokine）C-C subfamily結構域。CCL24和CCL5編碼蛋白二級結構均以α螺旋和隨機卷曲為主，間或有β轉角。通過分析CCL24和CCL5與斑點叉尾鮰CC趨化因子家族進化關系，發(fā)現(xiàn)CCL24與SCYA112同源性最高，CCL5與SCYA106同源性最高。 利用半定量RT-PCR檢測CCL24和CCL5在草魚精巢、頭腎、腎臟、肝胰臟、腸道

7、、肌肉和皮膚等不同組織中的表達，發(fā)現(xiàn)CCL24基因僅在腎臟和腸道中有表達，且腎臟的表達量要高于腸道；CCL5在草魚精巢、頭腎、腎臟、肝胰臟、腸道、肌肉、皮膚等組織均有表達，腎臟的表達最高，頭腎次之，在肝胰臟和精巢中的表達量最低。 草魚CC趨化因子基因CCL24存在可變剪接現(xiàn)象。CCL24基因開放閱讀框由四個外顯子和三個內含子組成，正常剪接的轉錄本編碼95個氨基酸的CC趨化因子，而另一個轉錄本保留了第一個內含予，導致密碼子移位，終