蒙古沙冬青干旱誘導(dǎo)表達(dá)SMART cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及序列分析.pdf

1、沙冬青是我國(guó)西北荒漠區(qū)特有的唯一常綠早生闊葉灌木，具有很強(qiáng)的抗寒和抗旱等抗逆特性。目前對(duì)于沙冬青抗逆性分子機(jī)理和抗逆基因的分離鑒定集中于抗寒性方面，有關(guān)其抗旱基因的分離和鑒定尚未見報(bào)道。本論文以蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)為材料，采用SMART(Switching Mechanism At 5'end ofRNA Transcript method)技術(shù)構(gòu)建了其在干旱脅迫下的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)

2、中的部分克隆進(jìn)行了5’端測(cè)序和序列分析，為進(jìn)一步開展表達(dá)譜分析和重要抗旱基因的克隆鑒定工作奠定了基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)首先對(duì)經(jīng)典熱酚法加以改進(jìn)，解決了蒙古沙冬青葉片總RNA提取中多糖和多酚類物質(zhì)污染嚴(yán)重的問(wèn)題，獲得符合建庫(kù)要求的高質(zhì)量總RNA。此外，還發(fā)現(xiàn)Promega公司的PolyATtract(R)mRNA Isolation Systems更適合于沙冬青mRNA的分離純化。
　　 以不同干旱脅迫處理的蒙古沙冬青混合mR

3、NA為模板合成cDNA，構(gòu)建了SMART全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。原始文庫(kù)的滴度和重組率分別為1.88×107 pfu/mL和97.87％，擴(kuò)增文庫(kù)的滴度為4.32x1010pfu/mL；插入片段大小在500~2500 bp之間，表明所建文庫(kù)質(zhì)量較高。
　　 將所構(gòu)建的(r)TripIEx2文庫(kù)轉(zhuǎn)化成pTriplEx2質(zhì)粒文庫(kù)，經(jīng)菌液PCR鑒定獲得3 500個(gè)陽(yáng)性克隆。將其中960個(gè)克隆進(jìn)行5’端測(cè)序，共獲得875個(gè)有效EST序列。將E