Riboswitch cDNA體外組裝及相關(guān)文庫(kù)構(gòu)建.pdf

1、Riboswitch稱為核糖開(kāi)關(guān),廣泛存在于各種生物體內(nèi),可以認(rèn)為是一類對(duì)小分子代謝物敏感的結(jié)構(gòu)RNA,通過(guò)結(jié)合小分子代謝物在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平調(diào)控基因表達(dá)。它們通常位于mRNA的5'-非翻譯區(qū)(5'-untranslated regions UTR),不編碼蛋白質(zhì),可以不依賴任何蛋白因子而直接結(jié)合小分子代謝物,繼而發(fā)生構(gòu)象重排,影響該mRNA的活動(dòng),調(diào)控小分子代謝物相關(guān)蛋白的表達(dá)。特異性與之結(jié)合的小分子代謝物一般為賴氨酸(Lysine),

2、黃素單核苷酸(flavin mononucleotide,FMN),硫胺素焦磷酸(Thiamine pyrophosphate,TPP),甘氨酸(glycine),維生素B12氰鈷銨(Cobalamin)等,其中與小分子結(jié)合的區(qū)域稱為適配體結(jié)構(gòu)域(aptamer domain,AD)。
　　 合成生物學(xué)的發(fā)展使得基因的人工合成變?yōu)榭赡?。由于利用傳統(tǒng)的堿基按序合成的方法來(lái)合成各種預(yù)期目的基因或者基因組序列既浪費(fèi)時(shí)間又浪費(fèi)資金,并且

3、合成的目標(biāo)序列有著很高的出錯(cuò)率,同時(shí)在多元平行構(gòu)建基因的過(guò)程中,需要大量合成短的寡核苷酸(oligos)。隨著科技的發(fā)展,微流體芯片技術(shù)的應(yīng)用可以使我們平行合成寡核苷酸的過(guò)程變的相對(duì)簡(jiǎn)單與高效。由此可使得人工合成基因的過(guò)程簡(jiǎn)化為連接組裝寡核苷酸片段。
　　 本論文以可程序控制的微流體PicoArray芯片平行合成的多元Riboswitch寡核苷酸(這些多元寡核苷酸經(jīng)過(guò)人為設(shè)計(jì)和改良)為材料,通過(guò)擴(kuò)增回收純化,混合成為寡核苷酸混合

4、物(OligoMix),酶切純化,連接與組裝,PCR擴(kuò)增,電泳檢測(cè)等過(guò)程組裝全長(zhǎng)的Riboswitch基因。通過(guò)對(duì)合成目的基因與載體的連接,轉(zhuǎn)化,克隆,提取質(zhì)粒,進(jìn)而對(duì)體外組裝結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。通過(guò)質(zhì)粒抽提,PCR,目的片段的回收純化與檢測(cè),含量檢測(cè),獲取Riboswitch目的基因的相關(guān)數(shù)據(jù)。將Riboswitch文庫(kù)中DNA分子所對(duì)應(yīng)的RNA序列進(jìn)行M-fold二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊預(yù)測(cè)。通過(guò)文獻(xiàn)查閱,按照配體的不同對(duì)Riboswitch分類,進(jìn)