中國(guó)甜柿cDNA-SSAP文庫(kù)構(gòu)建及自然脫澀相關(guān)基因功能驗(yàn)證.pdf

1、柿(Diospyros kaki Thunb.;2n=6x=90)原產(chǎn)中國(guó)，是柿屬植物中最具經(jīng)濟(jì)價(jià)值的栽培種，我國(guó)柿栽培面積和產(chǎn)量均居世界第一。但傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)多為完全澀柿(PCA)，需人工脫澀方能食用;而完全甜柿(PCNA)在樹(shù)上可自然脫澀，且其果實(shí)貨架期較長(zhǎng)，更具商品價(jià)值，是未來(lái)柿育種的重要目標(biāo)。已經(jīng)明確，中國(guó)原產(chǎn)完全甜柿（簡(jiǎn)稱(chēng)“中國(guó)甜柿”或C-PCNA）自然脫澀性狀受顯性單基因位點(diǎn)控制，因而在完全甜柿的遺傳改良中具有重大應(yīng)用潛力。前期研

2、究表明，中國(guó)甜柿自然脫澀可能涉及可溶性單寧的自然凝固過(guò)程，但其機(jī)理尚不完全清楚。
　　本文以中國(guó)甜柿為試材，首先利用SSAP技術(shù)構(gòu)建溫水脫澀差異表達(dá)cDNA文庫(kù)，獲得中國(guó)甜柿溫水脫澀過(guò)程中與“凝固效應(yīng)”相關(guān)的候選差異基因片段，同時(shí)結(jié)合非完全甜柿(non-PCNA)對(duì)溫水脫澀機(jī)理進(jìn)行初步探討;其次，基于cDNA-SSAP文庫(kù)篩選參與中國(guó)甜柿的自然脫澀的差異轉(zhuǎn)錄片段，通過(guò)RACE及染色體步移獲取其cDNA全長(zhǎng)，并利用柿葉片瞬時(shí)超表達(dá)技

3、術(shù)對(duì)候選基因功能驗(yàn)證;最后，應(yīng)用酵母單雜交系統(tǒng)篩選與脫澀基因互作的候選轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步探討中國(guó)甜柿自然脫澀的調(diào)控機(jī)理。本研究為中國(guó)甜柿可溶性單寧自然凝固的分子機(jī)理以及甜柿遺傳改良研究提供科學(xué)依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.應(yīng)用cDNA-SSAP技術(shù)構(gòu)建中國(guó)甜柿溫水脫澀前后差異轉(zhuǎn)錄的cDNA文庫(kù)，經(jīng)qRT-PCR分析及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)確認(rèn)了文庫(kù)數(shù)據(jù)的可靠性及準(zhǔn)確性。cDNA文庫(kù)包含差異轉(zhuǎn)錄條帶283條，Blast2GO分析顯示其主

4、要參與單寧合成、跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、糖酵解和果膠代謝等不同的生物學(xué)過(guò)程。
　　2.醛類(lèi)介導(dǎo)的“凝固效應(yīng)”及果膠的累積是柿果溫水脫澀的主要原因?；诓町惐磉_(dá)cDNA文庫(kù)新發(fā)現(xiàn)3條參與醛類(lèi)代謝候選基因片段，1條參與果膠代謝的差異轉(zhuǎn)錄片段，qRT-PCR分析顯示其在中國(guó)甜柿和非完全甜柿溫水脫澀過(guò)程中均上調(diào)表達(dá)。結(jié)合單寧及水溶性果膠含量測(cè)定，結(jié)果表明醛類(lèi)及果膠的累積是柿果溫水脫澀主要原因。
　　3.基于cDNA-SSAP文庫(kù)，篩選得到參與中國(guó)

5、甜柿自然脫澀的候選基因片段TDF284-2(PK基因)（轉(zhuǎn)錄條帶;transcript-derived fragment; TDF），利用RACE及Walking技術(shù)首次在柿屬植物上分離獲得6條DkPK的cDNA全長(zhǎng)。
　　4.DkPK1潛在參與中國(guó)甜柿的自然脫澀。分析6條DkPK基因在不同脫澀類(lèi)型柿果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式及其與可溶性單寧的關(guān)系，結(jié)果表明DkPK1表達(dá)變化與中國(guó)甜柿可溶性單寧含量呈高度負(fù)相關(guān);聚類(lèi)分析及亞細(xì)胞定位

6、顯示其為細(xì)胞質(zhì)PK，潛在參與調(diào)控及醛類(lèi)的代謝。瞬時(shí)超表達(dá)DkPK1可顯著降低柿葉片中可溶性單寧含量，同時(shí)顯著上調(diào)其下游醛類(lèi)代謝關(guān)鍵基因DkPDC1，3，4,5和DkADH1，3表達(dá)量。由此推測(cè)DkPK1的上調(diào)表達(dá)可促進(jìn)可溶性單寧的“凝固”進(jìn)而導(dǎo)致中國(guó)甜柿的自然脫澀，并提出中國(guó)甜柿自然脫澀分子機(jī)制模型圖。
　　5.分離得到4個(gè)DkPK1的上游調(diào)控因子?；贒kPK1全長(zhǎng)序列信息，通過(guò)染色體步移分離得到2，000 bp左右的啟動(dòng)子序列

7、。應(yīng)用酵母單雜交技術(shù)從酵母文庫(kù)中篩選分離140個(gè)目的單克隆，最終獲得4個(gè)與DkPK1互作的上游調(diào)控因子，分別為MADS-Box、WRKY、MYB和YABBY類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。此外，利用同樣方法分離得到3個(gè)與已知基因DkCAD1互作的候選轉(zhuǎn)錄因子。
　　綜上所述，基于SSAP技術(shù)，我們構(gòu)建了中國(guó)甜柿柿果溫水脫澀前后差異表達(dá)cDNA文庫(kù)，結(jié)合對(duì)非完全甜柿的分析，初步闡明乙醛介導(dǎo)的“凝固效應(yīng)”及果膠-單寧復(fù)合物的形成是導(dǎo)致柿果溫水脫澀主要原因