棉花鹽脅迫誘導(dǎo)cDNA文庫(kù)的構(gòu)建與篩選及棉花金屬硫蛋白基因功能分析.pdf

1、棉花是較耐鹽堿的作物之一，在鹽堿地區(qū)有大面積種植，已取得良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。但棉花的耐鹽能力仍然有限，常規(guī)品種耐鹽能力一般只有0.3％。所以，要在鹽堿地廣泛種植棉花，必須進(jìn)一步提高棉花的耐鹽能力。國(guó)內(nèi)外在這方面做了大量研究，然而分子水平的研究還有待于進(jìn)一步的深入下去。因此本研究分別以耐鹽棉花品種中棉19號(hào)為試材，構(gòu)建了棉花鹽脅迫誘導(dǎo)cDNA文庫(kù)，并通過(guò)反向northern差異篩選法獲得十七個(gè)與鹽脅迫相關(guān)的棉花基因克隆。并選擇5號(hào)和

2、17號(hào)克隆為研究對(duì)象，對(duì)這兩個(gè)克隆的序列及同源性分析表明二者屬于棉花金屬硫蛋白基因家族成員。 金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)是一類(lèi)低分子量(6000～9000Da)、高Cys含量、具有金屬結(jié)合能力的多肽，它具有獨(dú)特的氨基酸排列順序，即多肽的N端和C端具有兩個(gè)富含Cys的金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中的Cys按CXnC的方式排列。MT基因和蛋白廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌、綠藻中。植物金屬硫蛋白有其獨(dú)特的序列和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。根

3、據(jù)植物金屬硫蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，植物MT分為三類(lèi)。5號(hào)克隆編碼的GhMTl與17號(hào)克隆編碼的GhMT2為棉花Ⅰ類(lèi)金屬硫蛋白。對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行序列比較、表達(dá)分析和功能鑒定。 主要結(jié)果如下：1.利用ClontechK1053-1(634903)SmartTMcDNALibraryConstructionKit構(gòu)建棉花鹽脅迫誘導(dǎo)cDNA文庫(kù)，經(jīng)效價(jià)測(cè)定完全合格。 2.通過(guò)反向northern差異篩選法獲得十七個(gè)在鹽脅迫和正常條件下

4、表達(dá)有差異的克隆。 3.5號(hào)克隆和17號(hào)克隆的序列同源性分析表明，二者的核苷酸序列的同源性為91.15％，氨基酸同源性為85.94％，可以斷定二者為同一棉花基因家族成員。該基因家族編碼蛋白與復(fù)盆子、葡萄、中華獼猴桃、番木瓜等許多植物中的Ⅰ類(lèi)金屬硫蛋白的同源性為70.1％，具有典型的植物Ⅰ類(lèi)金屬硫蛋白序列特點(diǎn)，聚類(lèi)分析表明該棉花基因家族與復(fù)盆子、葡萄、中華獼猴桃、番木瓜等植物的Ⅰ類(lèi)金屬硫蛋白具有較近的親緣關(guān)系。因此，可以斷定二者屬

5、于植物Ⅰ類(lèi)金屬硫蛋白，命名為GhMT1、GhMT2。 4.Northern表達(dá)分析表明GhMT1受NaCl脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，在一定的時(shí)間范圍內(nèi)其表達(dá)水平隨NaCl誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，但是在鹽脅迫條件下不能被快速誘導(dǎo)。GhMT1也能被CuSO4、ZnSO4、低溫、干旱、ABA和乙烯誘導(dǎo)，說(shuō)明GhMT1具有金屬硫蛋白受重金屬誘導(dǎo)的功能，也說(shuō)明對(duì)鹽脅迫的非專(zhuān)一性，而是受各種非生物脅迫的誘導(dǎo)。同時(shí)暗示著GhMT1受ABA和乙烯信號(hào)途徑的調(diào)

6、控，可能是ABA、乙烯信號(hào)途徑的靶基因。 5.Northern表達(dá)分析還表明在抗氧化劑N-乙?；?L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)存在的條件下，GhMT1不受NaCl、低溫、干旱、百草枯(PQ，paraquat)的誘導(dǎo)。對(duì)過(guò)氧化氫相對(duì)水平的測(cè)定結(jié)果表明，NAC有效的抑制了NaCl、低溫、干旱脅迫條件下過(guò)氧化氫水平。說(shuō)明活性氧自由基是非生物脅迫誘導(dǎo)GhMT1及其同源家族表達(dá)的重要信號(hào)物質(zhì)。 6

7、.GhMT1和GhMT2在轉(zhuǎn)基因煙草中過(guò)量表達(dá)，用GhMT1和GhMT2特異探針標(biāo)記的northern雜交結(jié)果說(shuō)明GhMT1和GhMT2只在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)。同野生型相比，轉(zhuǎn)基因煙草能使轉(zhuǎn)基因煙草在200，300mMNaCl條件下，4℃條件下，25％PEG條件下較好的生長(zhǎng)。說(shuō)明GhMT1及其同源家族能提高植物的抗鹽能力，也能提高植物的抗其它主要非生物脅迫的能力。 7.對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草生理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明，在鹽、4℃、25％PEG脅迫