中國甜柿自然脫澀相關基因ALDH2的功能分析.pdf

1、中國甜柿自然脫澀性狀受顯性單基因控制，因而在完全甜柿遺傳改良中具有重大的應用價值，但其自然脫澀關鍵基因及其調控網(wǎng)絡尚不完全明確。已知中國甜柿自然脫澀過程與乙醛介導的“凝固效應”（即可溶性單寧向不溶性單寧的轉化過程）有關，但乙醛代謝下游的關鍵基因ALDH2（醛脫氫酶2基因家族）在其中的功能特性尚不清楚。本研究以中國甜柿（‘鄂柿1號’和‘羅田甜柿’），日本甜柿（‘陽豐’）和非完全甜柿（‘磨盤柿’）為試材，首先基于轉錄組數(shù)據(jù)庫中ALDH2基因

2、相關差異表達片段，從‘鄂柿1號’（Diospyros kaki Thunb.‘Eshi1’）中分離獲得了ALDH2基因家族成員的cDNA全長，分析其表達模式并利用柿葉片瞬時表達技術體系對ALDH2基因進行功能驗證;進而，應用酵母單雜交系統(tǒng)篩選與ALDH2基因互作的轉錄因子，進一步明確中國甜柿自然脫澀的分子調控網(wǎng)絡;最后，結合轉錄組測序技術和柿瞬時轉化體系，分析ALDH2及部分單寧代謝關鍵基因在中國甜柿葉片中瞬時超表達后的差異表達基因，進

3、一步挖掘與中國甜柿自然脫澀直接相關的候選基因，以期為中國甜柿自然脫澀分子機理的解析及其遺傳改良提供科學依據(jù)。
　　主要研究結果如下:
　　1.基于轉錄組數(shù)據(jù)庫中的序列信息，通過cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)技術獲得ALDH2基因家族兩個成員——DkALDH2a和DkALDH2b，其cDNA序列全長分別為1，984bp和1，933bp，分別編碼542和540個

4、氨基酸。DkALDH2a和DkALDH2b在中國甜柿葉片中瞬時超表達后，葉片可溶性單寧和不溶性單寧含量均顯著升高;瞬時干涉表達后，葉片中可溶性單寧含量前者無明顯變化，后者顯著降低。二者均可通過減少可溶性單寧的消耗進而抑制脫澀。
　　2.DkALDH2a主要作用于種子器官，其表達量在果實發(fā)育過程中逐漸降低，以致大量乙醛從種子擴散到果肉中，進而通過凝固效應促進脫澀。DkALDH2b主要是直接在果肉中大量表達，這可能是由于果肉中底物乙醛

5、的積累所致，但其消耗的乙醛不足以阻止中國甜柿自然脫澀。因此，DkALDH2a和DkALDH2b的表達量與中國甜柿自然脫澀呈負相關關系。
　　3.基于DkALDH2a和DkALDH2b全長序列信息，通過染色體步移技術分別分離到515bp和1，209bp啟動子序列。以DkALDH2b啟動子構建pALDH2b-AbAi誘餌載體并轉化Y1HGold酵母菌株，應用酵母單雜交技術從酵母文庫中篩選到16個陽性克隆，經(jīng)序列分析后新發(fā)現(xiàn)1個與ALD

6、H2b互作的BBR/BPC1轉錄因子。
　　4.結合轉錄組測序技術和柿瞬時轉化體系，篩選ALDH2及單寧代謝關鍵基因LAC1和ANR在中國甜柿葉片中瞬時超表達后的特異表達基因，共得到119.63GbClean Data。通過Trinity軟件從頭拼接(de novo assembly)，共得到192，597個轉錄本、100，371條Unigene。其中56，009條Unigene（約55.8％）獲得了功能注釋信息。注釋為ERF家族