蕪菁胚發(fā)育相關(guān)基因BcNAC2的功能分析.pdf

1、花的發(fā)育是植物發(fā)育過程中最引人注目的事件，花芽的形成意味生殖生長的開始(盧海宇等，2009)。Coen和Meyerowitz(1991)提出了花器官發(fā)育的ABC模型，這是植物發(fā)育分子生物學(xué)研究領(lǐng)域里程碑式的重大突破，也為人們打開了一扇通向花器官多樣性研究的大門。在蕓薹屬作物中，雄性不育現(xiàn)象普遍存在，并且應(yīng)用蕓薹屬作物的雄性不育性，利用雜種優(yōu)勢，提高產(chǎn)量，但雌性不育現(xiàn)象在蕓薹屬作物中卻鮮有報道。本研究以蕪菁(Brassica campes

2、tris L.ssp.rapifera(Matzg)Sinsk，syn.B.rapa L.)雌蕊退化突變體tpa(turnip pistil abortion)及其野生型(可育株)雌蕊和胚發(fā)育轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)的基因BcNAC2為研究對象，通過PCR擴增方法對蕪菁BcNAC2的cDNA全長和DNA全長進(jìn)行了分離、鑒定及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的預(yù)測；從NCBI上搜索到相關(guān)的NAC蛋白進(jìn)行同源比對，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建分子進(jìn)化樹；采用半定量RT-PCR(

3、Reverse transcriptase polymerase chain reaction)技術(shù)分析該基因在蕪菁不同發(fā)育階段的營養(yǎng)組織與生殖組織中的表達(dá)狀況；通過組織原位雜交的方法檢測授粉受精后該基因的表達(dá)部位；構(gòu)建了蕪菁反義BcNAC2的植物表達(dá)載體，用中國白菜的變種菜心(Brassicacampestris L.ssp.ckinensis var.utilis Tsen et Lee)為材料進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植

4、株，從分子生物學(xué)方面對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測和分析。研究結(jié)果如下：
　　 (1)在已有的cDNA-AFLP差異片段的基礎(chǔ)上，采用同源序列克隆技術(shù)獲得與雌蕊發(fā)育相關(guān)的蕪菁NAC轉(zhuǎn)錄因子--BcNAC2的cDNA和DNA序列全長。序列分析表明，BcNAC2的cDNA序列全長為2080 bp，最大ORF框為1683 bp，編碼560個氨基酸序列。其DNA序列全長中包含6個外顯子和5個內(nèi)含子，外顯子-內(nèi)含子交接處序列遵循GT-AG的普遍規(guī)律

5、，屬于的剪接體識別序列。其中內(nèi)含子的長度依次為67 bp、102 bp、269 bp、81 bp和83 bp。對推導(dǎo)的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該序列第9-159個氨基酸編碼NAC結(jié)構(gòu)域。利用SMART數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其為NAM亞家族蛋白。BcNAC2的二級結(jié)構(gòu)包含19.64％的α-螺旋，15.00％的β-折疊和65.36％的無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，三級結(jié)構(gòu)呈馬鞍形。此外，與擬南芥的NAC2蛋白的功能結(jié)構(gòu)域中的motif進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，蕪菁BcN

6、AC2與擬南芥AtNAC2功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)的特征序列有顯著的差異，主要區(qū)別在磷酸化位點上。在蕪菁BcNAC2蛋白的NAC結(jié)構(gòu)域內(nèi)，發(fā)現(xiàn)有2個N-糖基化位點(79～82，103～106氨基酸)，4個蛋白激酶C磷酸化位點(83～85，87～89，95～97，110～112氨基酸)，5個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(18～21，42～45，71～74，95～98，137～140氨基酸)，2個N-?；稽c(80～85，109～114氨基酸)。而在擬南芥

7、NAC2蛋白的結(jié)構(gòu)域中共發(fā)現(xiàn)有2個N-糖基化位點(57～60，79～82氨基酸)，1個環(huán)腺苷酸和鳥苷酸依賴的蛋白磷酸化激酶(53～56氨基酸)，3個蛋白激酶C磷酸化位點(42～44，61～63，72～74氨基酸)，3個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(30～33，37～40，72～75氨基酸)，2個酪氨酸激酶磷酸化位點(11～17，11～18氨基酸)，3個N-?；稽c(4～9，58～63，85～90氨基酸)。由此可知，蕪菁BcNAC2蛋白和擬南

8、芥NAC2蛋白結(jié)構(gòu)域內(nèi)的特征序列差異較為明顯，序列的差異是否會導(dǎo)致基因功能的不同，還需要后續(xù)進(jìn)一步的研究。
　　 (2)從NCBI上搜索下載相關(guān)的30個NAC蛋白與蕪菁BcNAC2進(jìn)行同源比對，構(gòu)建了分子進(jìn)化樹。結(jié)果表明，BcNAC2與擬南芥的AtNAC2、煙草的TERN和大豆的GmNAC6的親緣關(guān)系較近，可以歸為一類，均屬于NAM亞家族。其中BcNAC2與AtNAC2的親緣關(guān)系更近，說明同科植物的親緣關(guān)系較近。通過對NAM亞家

9、族的蛋白進(jìn)行序列比對發(fā)現(xiàn)，在N端的NAC保守結(jié)構(gòu)域處相似性較高，而在C端序列呈現(xiàn)多樣性，同源性較低，表明不同的NAC轉(zhuǎn)錄因子可能通過不同的C-端序列調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性，符合NAC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點。
　　 (3)采用半定量RT-PCR分析和組織原位雜交等兩種方法分析BcNAC2的表達(dá)特性。半定量RT-PCR分析了蕪菁BcNAC2在蕪菁不同發(fā)育階段中的表達(dá)動態(tài)，發(fā)現(xiàn)該基因有組成型表達(dá)特點，其中在小蕾、中蕾中的表達(dá)量較高，而在授粉受精后的

10、嫩角果中，授粉后8天的嫩角果表達(dá)量最高。該基因不僅在前期營養(yǎng)器官中能正常表達(dá)，而且在后期的種子或胚的形成過程中也有較高豐度的表達(dá)，暗示該基因在植物整個生長發(fā)育過程中都可能發(fā)揮著重要的作用。組織原位雜交分析結(jié)果表明，BcNAC2在授粉后4天胚珠的胚囊部位有較高的表達(dá)，而授粉8天的胚珠內(nèi)部也有較高豐度的表達(dá)，上述結(jié)果與半定量的分析結(jié)果基本一致，由此推測，BcNAC2參與了種子或胚的發(fā)育形成過程。
　　 (4)在正確分離反義BcNAC