龍眼子葉胚發(fā)育相關(guān)的若干基因克隆及序列分析.pdf

1、龍眼(Dimocarpus Longan Lour)屬無患子科(Sapindaceae)龍眼屬，是我國(guó)南方諸省較重要而有特色的一種熱帶亞熱帶木本果樹。由于龍眼合子胚遺傳背景復(fù)雜，童期長(zhǎng)，阻礙對(duì)其胚胎發(fā)育相關(guān)基因的研究。本文以龍眼子葉胚為材料，建立cDNA-AFLP技術(shù)體系，分析龍眼胚胎發(fā)育相關(guān)的基因差異表達(dá)，為研究龍眼胚胎發(fā)育奠定基礎(chǔ)。建立了RACE體系，克隆了看家基因3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)，并作為后續(xù)試驗(yàn)的內(nèi)參；以這個(gè)

2、RACE體系克隆了一系列與龍眼胚胎發(fā)育相關(guān)的基因，同時(shí)對(duì)這些基因在胚胎發(fā)育中的表達(dá)特性也進(jìn)行了研究。 1利用cDNA-AFLP技術(shù)分析龍眼子葉胚的發(fā)育 分別以小量法和大量法提取‘紅核子’龍眼謝花后35天子葉胚(早期子葉胚)和50天“紅核子”龍眼子葉胚(晚期子葉胚)的RNA，經(jīng)過合成雙鏈cDNA、酶切、加接頭、預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增一系列步驟，建立適宜于龍眼子葉胚的cDNA-AFLP分析體系，得到了條帶清晰、對(duì)應(yīng)良好、信號(hào)強(qiáng)度

3、基本一致、分布均勻的cDNA-AFLP指紋圖譜，對(duì)41個(gè)差異片段回收克隆和序列分析，發(fā)現(xiàn)其中21個(gè)與已知功能基因具有高度同源性，這些基因的功能主要涉及側(cè)生器官的離軸極性、糖酵解、能量代謝、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞壁伸長(zhǎng)、細(xì)胞周期調(diào)控、RNA轉(zhuǎn)錄、RNA翻譯和調(diào)控、蛋白磷酸化調(diào)控和降解、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等；另外20個(gè)片段與已知基因的同源性較低或未發(fā)現(xiàn)同源性。隨機(jī)挑選7個(gè)進(jìn)行RACE擴(kuò)增，RT-PCR檢測(cè)其表達(dá)情況。 2龍眼子葉胚GAPDH基因全長(zhǎng)c

4、DNA克隆及序列分析 根據(jù)Super SMARrTM PCR cDNA Synthesis Kit特點(diǎn)，設(shè)計(jì)兩端錨定引物，同時(shí)根據(jù)與已知的GAPDH基因高度同源的EST序列設(shè)計(jì)巢式引物，成功地?cái)U(kuò)增出該基因的3′端和5′端，說明這種RACE方法適合用于擴(kuò)增龍眼子葉胚的基因。 序列分析表明，該基因的cDNA全長(zhǎng)為1395bp，包括一個(gè)長(zhǎng)1008bp，編碼336個(gè)氨基酸的開放閱讀框，其核苷酸和氨基酸序列與其他物種的GAPDH基

5、因具有高度同源性。GAPDH基因是組成型表達(dá)，可以作為內(nèi)參基因。 3龍眼子葉胚離軸極性基因YABBY2的克隆和序列分析 采用巢式的RACE方法，獲得與擬南芥YABBY2同源的基因，共獲得三個(gè)全長(zhǎng)YAB2-1，YAB2-2，YAB2-3和三個(gè)片段YAB24，YAB2-5，YAB2-6。 生物信息學(xué)分析表明這幾個(gè)基因有不同的3′端非編碼區(qū)和5′端非編碼區(qū)，有高度一致的開放閱讀框，在YAB2-1，YAB2-2，YAB2

6、-3的5′端非編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)疑似的IRES序列。 半定量RT-PCR分析表明YAB2-3在早期子葉胚顯著地表達(dá)，在晚期子葉胚中微量表達(dá)；YAB2-1和YAB2-2在早期和晚期胚都顯著表達(dá)，但早期表達(dá)量大；YAB2-4是微量表達(dá)的基因，在晚期胚胎表達(dá)量較大。 4龍眼胚胎FVE、Remorin、CCR4-NOT等基因克隆和序列分析 采用巢式的RACE方法，成功地?cái)U(kuò)增龍眼的FVE、Remorin、CCR4-NOT的全長(zhǎng)序列

7、，獲得硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的5′端序列、脫水應(yīng)答蛋白相關(guān)基因3′端序列和幾丁質(zhì)酶基因3′端序列。FVE基因具有WD40superfamily結(jié)構(gòu)域，表達(dá)量極其顯著，早期表達(dá)量較大；Remorin基因在早期胚中顯著地表達(dá)，在晚期胚微弱地表達(dá)；CCR4-NOT基因在早期和晚期胚都顯著表達(dá)，早期胚胎表達(dá)量較大；硫轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因是微量表達(dá)的基因，在早期胚胎中表達(dá)量較大；幾丁質(zhì)酶基因也是微量表達(dá)的基因，在晚期胚胎表達(dá)量較大。脫水應(yīng)答蛋白的相關(guān)基因在早期胚