水稻側(cè)根發(fā)育基因OsCYP2（cyclophilin2）的克隆和功能分析.pdf

1、側(cè)根作為水稻胚后發(fā)育的重要器官,在水稻根構(gòu)型建立中起著重要的作用。盡管對水稻側(cè)根的形態(tài)和生理已經(jīng)有了詳盡的描述,但是對于控制水稻側(cè)根形成的相關基因所知不多,因此對水稻側(cè)根發(fā)生機制的研究及關鍵基因的克隆意義重大。本研究通過對側(cè)根形成相關突變體的篩選,獲得3個水稻側(cè)根突變體,lrll(秈稻Kasalath)、lrl2(粳稻中花-11)、lrl3(粳稻中花-11)。圖位克隆證明,三個突變體為OsCYP2基因的等位突變體,記為Oscyp2-1,

2、Oscyp2-2,Oscyp2-3,通過對突變體表型、激素、遺傳分析以及基因克隆和功能分析,我們得到以下主要研究結(jié)果： 1.OsCYP2功能缺失突變導致了側(cè)根原基形成受阻,向重力性反應遲緩,而且伴隨著發(fā)育進程,在地上部長度、主根長度、不定根數(shù)量及平均長度、側(cè)根數(shù)量及平均長度上與野生型的差異加大,花藥觀察和花粉活力檢測及生育期觀察的結(jié)果表明OsCYP2的突變嚴重影響了植株的生殖發(fā)育,使得花藥發(fā)育異常,顏色發(fā)白,花粉活力極差,分蘗數(shù)

3、少,結(jié)實率差,千粒重降低等。 2.與野生型比較,等位突變體Oscyp2-1,Oscyp2-2,Oscyp2-3的NPA反應基本相似。外源施加的0.1μM NAA并不能恢復等位突變體Oscyp2-1,Oscyp2-2,Oscyp2-3側(cè)根突變的表型,反而誘導了突變體Oscyp2-1的側(cè)根伸長,而野生型Kasalath的側(cè)根長度表現(xiàn)明顯抑制。IAA含量測定表明,突變體lrll葉片和根IAA含量與野生型Kasalath比較都沒有顯著差

4、異(P>0.05)。這些結(jié)果表明突變體側(cè)根形成過程中生長素信號途徑受到了嚴重破壞。 3.遺傳分析表明,等位突變體Oscyp2-1,Oscyp2-2,Oscyp2-3為單基因隱性突變。利用圖位克隆策略克隆了OsCYP2基因。OsCYP2基因定位在第2條染色體短臂上dEcoRI和PmaCI之間,為BAC克隆OSJNBb0088N06和OJ1020-C02所覆蓋。三個等位突變體的突變位點不同:Oscyp2-1突變體在OsCYP2編碼框

5、215bp處發(fā)生了堿基替換,G變?yōu)镃;Oscyp2-2在OsCYP2基因編碼框75bp處發(fā)生了堿基替換,C變?yōu)锳;Oscyp2-3在OsCYP2基因編碼框44-102bp處發(fā)生了59bp的堿基缺失。 4.OsCYP2蛋白序列分析表明,在Oscyp2-1中,第72個甘氨酸(G)變?yōu)楸彼?A);在Oscyp2-2中,第25個半胱氨酸(C)變?yōu)榻K止密碼子(stop),只編碼了24個氨基酸；在Oscyp2-3中,第15個丙氨酸到第35

6、個谷氨酸缺失,從而產(chǎn)生移碼突變。同源性分析發(fā)現(xiàn),OsCYP2具有4個保守的氨基酸,可能是植物在cyclophilin家族進化過程中所特有的。 5.OsCYP2基因組織表達分析表明,該基因在各組織器官中組成性表達,突變體中OsCYP2基因在根、根莖結(jié)合部、莖、葉和花中的表達與野生型差異不明顯。半定量和定量RT-PCR分析證明,OsCYP2的突變影響了部分生長素響應的基因表達(比如OsPIN10a,OsIAA20等),表明OsCYP2基因可