甜黑米黑色種皮基因的功能分析.pdf

1、近年來，有關(guān)花青素合成途經(jīng)中的調(diào)控基因已經(jīng)被廣泛的研究。本文在前期甜黑米黑色種皮基因基因定位的基礎(chǔ)上，對候選基因Ra進(jìn)行了功能驗證，并展開了其功能的研究分析。
　　首先，我們將Ra基因和含有GT插入的等位基因Ru分別構(gòu)建過表達(dá)載體。瞬時表達(dá)實驗表明，顯性的Ra基因可以促進(jìn)日本晴糊粉層中色斑的沉積，相反的，Ru基因及對照均不能實現(xiàn)沉積，這說明Ra參與調(diào)控花青素的合成，而GT的插入則影響其功能的發(fā)揮。此外，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法分別在日

2、本晴中過表達(dá)和在甜黑米中干擾Ra基因，轉(zhuǎn)基因植株的表型仍在進(jìn)一步驗證中。
　　其次，通過水稻原生質(zhì)體的瞬時表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Ra基因編碼的bHLH轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞中是核定位，Ru基因所編碼的對應(yīng)蛋白同樣如此，說明GT的插入并沒有改變其轉(zhuǎn)錄因子的核定位特性。
　　為了驗證Ra基因通過bHLH-MYB-WD40復(fù)合物參與調(diào)控，我們克隆了相應(yīng)基因并通過酵母雙雜實驗研究Ra基因形成復(fù)合物的模式。結(jié)果顯示，Ra基因所編碼的bHLH蛋白可以與Os

3、MYB3和OsMYB4編碼的R2R3MYB蛋白以及WD40蛋白互作。GT的插入并不影響復(fù)合體的形成;
　　最后，我們收集45個不同來源的白米、紅米及紫黑米品種并對其進(jìn)行了Ra與Rc位點的基因型鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在紅米品種為raraRcRc型，黑米品種為RaRarcrc，而白米品種則為rararcrc型。這說明Ra與Rc的基因可能通過調(diào)控不同的結(jié)構(gòu)基因來影響花青素物質(zhì)的積累。我們選取了代表性的黑米（甜黑米）、紅米（kasalath）和白

4、米（日本晴）品種，對其花青素合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行了表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑米中各基因的表達(dá)量均顯著高于白米品種，且促進(jìn)原花青素形成的基因LAR和ANR則表達(dá)量相對較低。相反的，紅米品種中，促進(jìn)花青素合成的基因ANS表達(dá)量較低。這一結(jié)果說明Ra基因主要通過促進(jìn)ANS基因來加強黑米種皮中花青素物質(zhì)的積累，而紅米品種中的Rc基因則不能有效促進(jìn)ANS的表達(dá)，所以種皮中以積累原花青素為主。這一結(jié)論與黑米和紅米的物質(zhì)測定結(jié)果相吻合。
　　對于