花椰菜黑腐病抗性相關(guān)基因的分離及功能分析.pdf

1、由野油菜黃單胞桿菌野油菜致病變種Xanthomonas campestrts pv. campestris(Xcc)引起的黑腐病(Black rot)是世界范圍內(nèi)花椰菜生產(chǎn)的主要病害之一，該病原菌能感染所有十字花科植物，尤其對(duì)甘藍(lán)類(Brassica oleracea)蔬菜的生產(chǎn)是破壞性的，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)大幅下降。目前尚無(wú)行之有效的防治方法。從分子水平上研究花椰菜抗黑腐病的機(jī)制，對(duì)花椰菜的生產(chǎn)及育種實(shí)踐具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。本研究以

2、花椰菜抗、感黑腐病的近等位基因系C712和C731為材料，利用抑制性消減雜交(SSH)技術(shù)和Operon公司的擬南芥寡核苷酸芯片，分離和檢測(cè)抗病品系C712在Xcc脅迫后的差異表達(dá)基因，并對(duì)部分差異表達(dá)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能分析，初步揭示了Xcc誘導(dǎo)的抗性相關(guān)基因的種類和數(shù)量及其參與的代謝和信號(hào)傳導(dǎo)途徑，為深入研究花椰菜抗黑腐病的機(jī)制及利用抗性資源進(jìn)行抗病品種選育和改良奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1．將田間采集的花椰菜典型

3、黑腐病病樣經(jīng)分離、純化后，從形態(tài)、生理生化及分子方面進(jìn)行了鑒定和回接鑒定，確定了所分離的病原菌為花椰菜黑腐病的致病菌-野油菜黃單胞桿菌野油菜致病變種。
　　 2．建立優(yōu)化了花椰菜黑腐病苗期人工接種的方法，即接種方法為針刺法，接種時(shí)期為4-5葉期，接種菌液濃度為1.0x108cfu/mL，環(huán)境溫度控制在25℃-30℃，病程為14d。
　　 3．分別以花椰菜抗、感黑腐病的近等位基因系C712和C731為“Tester”和“D

4、river”，利用SSH技術(shù)構(gòu)建了Xcc誘導(dǎo)的包含1，476個(gè)陽(yáng)性克隆的正向消減cDNA文庫(kù)。利用反向Northern雜交技術(shù)從陽(yáng)性克隆中篩選出280個(gè)Xcc誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的克隆，測(cè)序后得到202條單一序列(unigene)。Blast分析結(jié)果表明182個(gè)unigenes與NCBI中已知基因高度同源，占全部非重復(fù)序列的90.1％。按MIPS的分類方法對(duì)已知功能基因進(jìn)行功能分類，發(fā)現(xiàn)這些差異表達(dá)基因的功能主要涉及物質(zhì)及能量代謝、信號(hào)傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)

5、錄調(diào)控、苯丙烷代謝途徑及防衛(wèi)反應(yīng)等。另有20條unigenes在GenBank中沒(méi)有查到對(duì)應(yīng)的同源序列，可能為新基因。
　　 4．采用Operon公司的擬南芥70mer寡核苷酸芯片，以接種Xcc Oh的葉片為對(duì)照，分析了花椰菜抗病系C712在Xcc接種后24h的基因表達(dá)譜差異。在29，110個(gè)探針中，共檢測(cè)到10，004個(gè)表達(dá)位點(diǎn)，占芯片總位點(diǎn)數(shù)的34.4%，有效差異表達(dá)Ratio值≥2或≤0.5的基因共1，629個(gè)，其中上調(diào)表

6、達(dá)基因1，010個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因619個(gè)。選取30個(gè)參與不同代謝途徑的上調(diào)和下調(diào)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明，擬南芥70mer寡核苷酸芯片能較真實(shí)地反映花椰菜在Xcc脅迫后部分基因表達(dá)水平的變化，說(shuō)明擬南芥70mer寡核苷酸芯片可用于花椰菜基因差異表達(dá)的研究。通過(guò)Gene ontology(GO)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因在抗病過(guò)程中參與不同生理代謝途徑，這些基因的功能主要涉及防御反應(yīng)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、基因轉(zhuǎn)

7、錄等，推測(cè)花椰菜對(duì)Xcc的抗性是由多基因參與的多種代謝途徑協(xié)同作用的結(jié)果。
　　 5．在抗病系C712接種Xcc后24h，大量與植物系統(tǒng)獲得抗性（SAR）有關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)，表明SAR在花椰菜抗黑腐病的過(guò)程中可能起到了重要的作用。同時(shí)還檢測(cè)到大量參與SA、Et和JA信號(hào)傳導(dǎo)途徑的基因上調(diào)表達(dá)，表明這3個(gè)途徑均參與了花椰菜對(duì)Xcc的防御反應(yīng)。特別是JA/Et共同誘導(dǎo)的CEJ1和PDFl.2上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明JA/Et共同誘導(dǎo)的植物信號(hào)

8、傳導(dǎo)途徑參與了花椰菜對(duì)Xcc的防御反應(yīng)，JA/SA共同誘導(dǎo)的PAL基因上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明防御反應(yīng)中可能還存在JA/SA共同誘導(dǎo)的信號(hào)途徑。
　　 6．差異表達(dá)基因的KOBAS分析結(jié)果顯示，花椰菜在Xcc脅迫下參與苯丙烷代謝途徑的多個(gè)關(guān)鍵基因均上調(diào)表達(dá)，如4CL，CAD，CYP450，PAL等，表明該代謝途徑可能是花椰菜對(duì)Xcc防御機(jī)制的基礎(chǔ)。
　　 7．根據(jù)抑制性消減cDNA文庫(kù)和擬南芥寡核苷酸芯片所得差異表達(dá)序列的功能注釋

9、，挑選18個(gè)可能與抗性相關(guān)的基因(AIG、APX1、CHI、CaR、CYP450、CHS、PDFl.2、GSH-Px、GST, LTP、 MPK4、PAL、PGIPl、Proteinase inhibitor14、RubisCO，TLP，Trh、WRKY11)，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)其在抗、感病花椰菜中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果表明，這些基因在花椰菜葉片中均為組成型表達(dá)，在Xcc脅迫后，無(wú)論是抗病品系還是感病品系這些基因的表達(dá)都發(fā)生變化

10、，但在抗、感病花椰菜中具有明顯不同的表達(dá)模式，多數(shù)基因在抗病花椰菜中對(duì)Xcc的響應(yīng)要早于感病花椰菜，并且在表達(dá)水平上抗病花椰菜也高于感病花椰菜。
　　 8．采用RT-PCR技術(shù)從抗病花椰菜中克隆出BoMPK3、BoMPK4、BoWRKY11、BoPAL、BoTLP、BoAPXl, BoAPX2、BonsLTP、BoTrxh、BoPDFl.2、BoPGIPl、BoCHS等在抗、感病材料中表達(dá)模式存在差異的基因的編碼序列，生物信息學(xué)

11、分析表明，這些基因與植物抗病性存在一定的關(guān)系。
　　 9．為了進(jìn)一步研究BoMPK3、BoMPK4、Bo WRKY11、BoPAL、BoTLP、BoAPX1、BonsLTP、BoTrx、BoPDF1.2、BoPGIP1、BoCHS等基因與花椰菜黑腐病抗性之間的關(guān)系，明確其在花椰菜抗黑腐病方面的作用，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pX6-BoMPK3、pB1101-BoMPK4、pX6-BoWRKY11、 pX6-BoPAL、 pBI21-B

12、oTLP、pRI101-BoAPX1、pX6-BoAPX2,pBI121-BonsLTP、pRI101-BoTrx h、pBI121-BoPDF1.2、pBI121-BoCHS)。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將BoWRKYl1、BoPAL、BonsL TP、Bo Trxh、BoPDF1.2等5個(gè)基因轉(zhuǎn)化花椰菜感病系C731，獲得了卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化株系。采用人工接種的方法對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行黑腐病抗病性鑒定，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)PAL基因的花椰菜抗病性明顯增強(qiáng)，說(shuō)

13、明PAL在花椰菜抗黑腐病過(guò)程中起一定的積極作用，并且PAL參與的苯丙烷代謝途徑可能在花椰菜抗黑腐病的過(guò)程中起重要作用。
　　 綜上所述，花椰菜對(duì)Xcc的抗性是通過(guò)多種代謝及信號(hào)傳導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的，是多基因共同的作用結(jié)果，而且各防御途徑間不是孤立的，存在著各種形式的相互作用，有重疊也有交叉，并以此為基礎(chǔ)形成了由不同形式的抗性信號(hào)傳導(dǎo)途徑組成的復(fù)雜的防御網(wǎng)絡(luò)，以此來(lái)精確調(diào)控花椰菜對(duì)Xcc的抗性反應(yīng)。單條途徑的加強(qiáng)都會(huì)對(duì)其它途徑造成拮抗，