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文檔簡介
1、花椰菜是十字花科蕓薹屬甘藍種中以花球為產(chǎn)品的一個變種,具有重要的經(jīng)濟價值。但在栽培過程中,黑腐病的大流行會使蔬菜品質嚴重下降,造成大幅度減產(chǎn),使得針對該病成因及預防的研究成為科學家關注的熱點。但是目前對植物抗黑腐病的研究進展主要集中在該病的遺傳規(guī)律,以及對致病菌侵染的應答模式等方面,而在分子水平上對于抗黑腐病基因的研究卻很少。本論文通過篩選抗黑腐病基因相關分子標記,同時結合電子克隆技術尋找候選的抗病基因,該研究對推進防治黑腐病的進程具有
2、重要理論意義和應用價值。本文以花椰菜抗感黑腐病一對近等基因系為實驗材料,在抗黑腐病基因篩選的研究中,首次將ISSR分子標記與電子克隆技術相結合,獲得一個與花椰菜抗黑腐病相關候選基因BRR-C,然后采用Southern雜交技術證明了BRR-C在抗、感花椰菜黑腐病材料中的多態(tài)性。進一步將RT-PCR技術與RQ-PCR技術相結合,相應于菌體脅迫前后以及時間長度的變化,在抗、感花椰菜黑腐病材料中觀察到與預期相符的BRR-C表達趨勢,從而推測BR
3、R-C很可能參與了花椰菜抗黑腐病的防衛(wèi)機制,并對BRR-C可能參與的抗病機制進行了探討。同時根據(jù)ISSR分子標記及BRR-C序列設計了三對SCAR標記引物,這對分子標記技術輔助抗性育種的應用具有重要意義。主要結果如下:
⑴應用ISSR分子標記技術,從近等位基因系材料中篩選得到了兩條差異明顯且重復性好的條帶,即ISSR21200,ISSR17800。經(jīng)過克隆測序后分析發(fā)現(xiàn),ISSR17800與Brassica napus v
4、at.napus的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AJ245479)具有93%的同源性;而ISSR21200與擬南芥中的一段EST序列(AK228713,hypothetical protein)有85%的同源性。
⑵利用分子標記ISSR21200作為種子序列,通過電子克隆技術獲得抗黑腐病候選基因BRR(black rot resistance candidate genes)。隨后依據(jù)BRR設計特異引物,在花椰菜基因組中分離到1
5、條候選基因BRR-C(black rot resistance candidategenes of cauliflower),經(jīng)過克隆測序后分析發(fā)現(xiàn),該序列全長2204bp,包含2個外顯子和2個內(nèi)含子,共編碼484個氨基酸,與擬南芥逆轉錄轉座子的逆轉錄酶基因存在高同源性。
⑶采用Southern雜交技術,將BRR-C與抗、感花椰菜黑腐病基因組進行雜交,結果表明BRR-C在抗、感病性材料中存在明顯多態(tài)性,并且在花椰菜基因組中
6、以低拷貝形式存在。
⑷依據(jù)BRR-C含有的保守序列設計一對特異引物,進行RT-PCR分析,結果表明BRR-C在脅迫條件下表達豐度提高。隨后以不同時間段XCC脅迫的近等位基因系為材料,進行RQ-PCR(real-time-quantimtive PCR)分析,結果表明花椰菜中BRR-C的表達確實受到XCC的誘導。因此,我們認為BRR-C參與了花椰菜抗黑腐病的防衛(wèi)機制,這為進一步克隆花椰菜抗黑腐病基因提供了可靠的候選基因。
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