花椰菜胞質(zhì)不育及育性保持相關(guān)基因的克隆與分析研究.pdf

1、花椰菜屬十字花科，蕓薹屬，是一種重要的蔬菜類作物。利用花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及相應(yīng)的保持系、優(yōu)良父本所進(jìn)行的雜交優(yōu)勢(shì)利用，已廣泛用于花椰菜高品質(zhì)雜交種的生產(chǎn)。但在實(shí)際育種中，可利用的花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育資源十分有限，而選育或創(chuàng)建新型花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的理論基礎(chǔ)尚不健全，這在很大程度上阻礙了花椰菜雜交優(yōu)勢(shì)的利用。為此，開(kāi)展花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)分子機(jī)制的研究，不但可為利用花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系進(jìn)行雜交制種提供理論支持，而且也可在深層

2、次上認(rèn)識(shí)花椰菜細(xì)胞內(nèi)核質(zhì)互作的機(jī)理。 本論文以花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和相應(yīng)的保持系為材料開(kāi)展了如下方面的研究： 1.基于同源序列的候選基因克隆法，選定7個(gè)最有可能與花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)的基因，分別為atpa、atp6、atp9、coxⅠ、coxⅡ、orfB和orf224，最終確定orfB與其雄性不育密切相關(guān)。對(duì)orfB的轉(zhuǎn)錄分析表明，orfB只在細(xì)胞質(zhì)雄性不育花椰菜中轉(zhuǎn)錄。序列分析表明，orfB與Ogura型胞質(zhì)不育

3、蘿卜的雄性不育相關(guān)基因orf138高度同源。進(jìn)一步分析，利用報(bào)道的orf128位點(diǎn)處的序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增，在花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中克隆到包含orfB全長(zhǎng)的一段序列。該序列結(jié)構(gòu)與Ogura型胞質(zhì)不育蘿卜orf138位點(diǎn)處的一致，含有三個(gè)可編碼區(qū)：trnfM、orf138和orf158。轉(zhuǎn)錄分析顯示其中的orf138和orf158與Ogura型胞質(zhì)不育蘿卜中的一樣可共轉(zhuǎn)錄。但對(duì)這些轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RNA編輯分析發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞質(zhì)雄性不育花椰菜

4、中orfB位點(diǎn)處的RNA編輯，可能有著特殊的編輯機(jī)制，并且發(fā)現(xiàn)有個(gè)別位點(diǎn)的RNA編輯在細(xì)胞質(zhì)雄性不育花椰菜和Ogura型胞質(zhì)不育蘿卜中有所不同。因此，認(rèn)為盡管實(shí)驗(yàn)所用花椰菜不育系也為Ogura型胞質(zhì)不育，但二者雄性不育的具體形成機(jī)制有所不同。 2.采用同源序列的候選基因克隆方法，克隆了花椰菜兩系內(nèi)的線粒體基因nad3/rps12。分析發(fā)現(xiàn)該基因位點(diǎn)處的基因結(jié)構(gòu)在兩系中存在差異，但基因在轉(zhuǎn)錄水平未表現(xiàn)出不同。進(jìn)一步對(duì)該基因在兩系中

5、的RNA編輯情況進(jìn)行了深入研究。采用cDNA-SSCP結(jié)合測(cè)序技術(shù)共檢測(cè)到12種不同的RNA編輯模式，20個(gè)RNA編輯位點(diǎn)。其中特異出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中的RNA編輯模式有9種，在保持系中的有3種。RNA編輯位點(diǎn)在細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中主要以C到U的不完全編輯為主，而在保持系中完全編輯和提前編輯的位點(diǎn)占優(yōu)勢(shì)。結(jié)果表明基因nad3/rps12的RNA編輯在花椰菜兩系中存在明顯不同，推測(cè)其與花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育的發(fā)生有關(guān)。 3.對(duì)花椰

6、菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系的基因組進(jìn)行了RAPD和ISSR分析。篩選了406條RAPD引物，檢測(cè)到了2160條清晰可辨的條帶，而其中只有引物S2121在保持系中擴(kuò)增出一條約900bp的特異帶。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物將其轉(zhuǎn)化成特異PCR標(biāo)記，命名為S2121900。隨后又篩選了30條ISSR引物，在兩系中共擴(kuò)增出306條清晰可辨的條帶，只有引物ISSR3在兩系的擴(kuò)增中表現(xiàn)出多態(tài)性，在保持系可檢測(cè)到一條約1100bp的特異條帶，命名為IS

7、SR31100。為進(jìn)一步驗(yàn)證S2121900和ISSR31100的特異性，又對(duì)其分別進(jìn)行了Southern斑點(diǎn)雜交分析，單株及已知育性花椰菜材料檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)S2121900和ISSR31100確為花椰菜保持所特有。序列分析表明，S2121900與甘藍(lán)型油菜及擬南芥線粒體基因相應(yīng)區(qū)段高度一致，并且序列中存在多個(gè)潛在的RNA編輯位點(diǎn)。推測(cè)S2121900極有可能來(lái)源于花椰菜線粒體基因組，且具有編碼功能。初步的轉(zhuǎn)錄分析也證實(shí)S2

8、121900在保持系中表現(xiàn)為特異性轉(zhuǎn)錄，可檢測(cè)到一條約350bp的特異轉(zhuǎn)錄物。ISSR31100也與報(bào)道的一些線粒體基因序列具較高同源性，推測(cè)其也源于花椰菜保持系線粒體基因組，但還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。 4.采用DDRT-PCR技術(shù)對(duì)花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系內(nèi)基因的差異表達(dá)情況進(jìn)行分析。選用了3條錨定引物，15條隨機(jī)引物進(jìn)行組合，最終共獲得1122條大小在1000-50bp的帶。經(jīng)反向Northern雜交驗(yàn)證，其中的4條在兩系

9、中表現(xiàn)為差異表達(dá)，分別命名為NKC-6205、NKC-6383、NKC-68307和NKC-68352，其中NKC-6205和NKC-6383在不育系中特異表達(dá)，NKC-68307和NKC-68352在保持系中特異表達(dá)。分析表明4個(gè)差異序列均未見(jiàn)報(bào)道。其中NKC-6205、NKC-68307至今尚未發(fā)現(xiàn)與之相似的序列，有待于進(jìn)一步研究；NKC-6383、NKC-68352與報(bào)道的擬南芥、菠菜、玉米、煙草等的葉綠體基因的一些片段具較高相似

10、性，推測(cè)NKC-6383、NKC-68352可能來(lái)源于花椰菜葉綠體基因組。 5.利用在花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系中獲得的特異擴(kuò)增orfB，轉(zhuǎn)化成細(xì)胞質(zhì)雄性不育花椰菜特異分子標(biāo)記，命名為orfB300及對(duì)兩系RAPD和ISSR分析獲得的花椰菜保持系特異分子標(biāo)記S2121900和ISSR31100，對(duì)收集到的花椰菜材料進(jìn)行篩查。結(jié)果顯示，在所有細(xì)胞質(zhì)雄性不育花椰菜中都可檢測(cè)到orfB300，而在所有可育花椰菜中都可檢測(cè)到S2121900

11、和ISSR31100。證明目前實(shí)驗(yàn)所用的花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系都具有同樣的胞質(zhì)類型，而檢測(cè)到的可育花椰菜都可能作為優(yōu)良父本配制花椰菜雜種。同時(shí)，利用orfB300對(duì)以O(shè)gura型胞質(zhì)不育青花菜為不育源，經(jīng)回交轉(zhuǎn)育獲得的6個(gè)球莖甘藍(lán)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的胞質(zhì)類型進(jìn)行了鑒定，在分子水平確定轉(zhuǎn)育成功。 6.對(duì)辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系、恢復(fù)系及F1代進(jìn)行RAPD分析，共篩選了336條RAPD引物，其中引物S418在恢復(fù)系中呈現(xiàn)特異性擴(kuò)增，得到一

12、條約3000bp的特異片段。回?cái)U(kuò)得到兩條片段，測(cè)序表明大小分別為1515bp和1162bp。熒光原位雜交證實(shí)1515bp片段為恢復(fù)系特有，命名為S4181515；序列分析表明S4181515為一新發(fā)現(xiàn)的序列，Blastn序列比對(duì)同源性小于40％，tBlastx比對(duì)發(fā)現(xiàn)該序列與水稻2、4、7、10號(hào)染色體的幾個(gè)BAC克隆上的序列高度同源，推測(cè)可能與其具有相似的編碼功能。該研究為下一步克隆辣椒育性恢復(fù)基因奠定了基礎(chǔ)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物