不結(jié)球白菜溫敏型胞質(zhì)雄性不育的分子標(biāo)記和相關(guān)基因的克隆與表達分析.pdf

1、以不結(jié)球白菜溫敏型(Pol)胞質(zhì)雄性不育系04p20及其保持系04p21為材料，分析其雄性不育相關(guān)的生理生化特性，對其基因組DNA進行RAPD、AFLP和sSR分析，并對胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因進行克隆和表達分析，以求進一步探明胞質(zhì)雄性不育的分子機理，為進一步利用溫敏型(Pol)胞質(zhì)雄性不育奠定了基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1.不結(jié)球白菜溫敏型胞質(zhì)雄性不育的生理生化特性 對不結(jié)球白菜溫敏型(Pol)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系的生

2、理生化特性研究結(jié)果表明：不育系不同大小的蕾和花中可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)和脯氨酸以及游離態(tài)、結(jié)合態(tài)和束縛態(tài)的精胺、亞精胺、腐胺含量均顯著低于其保持系，而在葉片中三種形態(tài)的多胺含量無差異；孢原細胞分化期雄性不育系花蕾中多胺含量顯著低于保持系，顯示多胺含量不足可能與不結(jié)球白菜Pol胞質(zhì)雄性不育系小孢子發(fā)育受阻有關(guān)；SOD、POD和CAT活性則是不育系高于其保持系；POD同工酶電泳分析也發(fā)現(xiàn)不育系POD含量及其活性高于其保持系，這些結(jié)果表明上述

3、物質(zhì)含量和酶活性與不結(jié)球白菜Pol胞質(zhì)雄性不育相關(guān)。 2.對不結(jié)球白菜溫敏型胞質(zhì)雄性不育系及其保持系基因組DNA進行RAPD、AFLP分析 用386條隨機引物對不育系及其保持系的基因組DNA進行RAPD分析，其中346條引物在兩系中都得到了擴增產(chǎn)物，62條引物的擴增結(jié)果在兩系之間表現(xiàn)出了遺傳多態(tài)性。在不育系中獲得特異片段OPAY1000，序列測定OPAY1000序列全長為1053bp，在GenBank中的登錄號為DQ32

4、0101。此序列編碼175個氨基酸，在NCBI上用tblastx軟件進行相似性檢索后發(fā)現(xiàn)其與擬南芥蘇氨酸肽鏈內(nèi)切酶有76個氨基酸相似，相似性為55％。根據(jù)序列測定結(jié)果設(shè)計了一對特異引物，將OPAY1000轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記。 用72對AFLP引物組合對不育系及其保持系的基因組DNA進行AFLP分析，篩選與雄性不育相關(guān)的特異片段。經(jīng)過重復(fù)驗證，得到三條特異片段BCMS1、BrCMS2、BrCMS3，對這些特異片段進行克隆測序分析表

5、明：BrCMS1和油菜的一個反轉(zhuǎn)錄基因有90％的相似性，與擬南芥一號染色體的BAC F1106有90％的相似性；BrCMS2與日本水稻的一個cDNA克隆全長的部分氨基酸有58％的相似性；BrCMS3與甘藍克隆A的全序列有93％的相似性。Souuthem點雜交結(jié)果與AFLP分析結(jié)果一致。這3個序列在GenBank的登錄號分別為DQ513189、DQ513190和DQ513191。本研究揭示了不結(jié)球白菜Pol胞質(zhì)雄性不育系和其保持系在核DN

6、A上存在差異。 3.不結(jié)球白菜溫敏型胞質(zhì)雄性不育系及其保持系線粒體基因組的比較分析 對不育系和其保持系的線粒體DNA進行RAPD分析，結(jié)果表明：在285條引物的擴增產(chǎn)物中，不育系和保持系線粒體DNA之間存在差異，在不育系中獲得兩條特異帶AY1200和RD800，序列分析發(fā)現(xiàn)RD800序列與貝氏柯克斯體QpH1質(zhì)粒全基因組序列的132個氨基酸有47％的相似性；AY1200與擬南芥的鐵氧化還原蛋白依賴的谷氨酸鹽合成酶的65個

7、氨基酸有33％的相似性，此結(jié)果顯示不育系和保持系線粒體基因組問存在差異。 4.不結(jié)球白菜溫敏型胞質(zhì)雄性不育系葉綠體DNA的SSR分析 從36對煙草葉綠體SSR引物中篩選出10對能用于不結(jié)球白菜的葉綠體SSR引物，應(yīng)用這10對引物對不育系和保持系的葉綠體基因組進行SSR分析。結(jié)果顯示兩系間擴增片段的多態(tài)性較小，獲得了一條在不育系出現(xiàn)的特異片段?？寺y序表明此特異片段的核苷酸序列含T堿基的11次重復(fù)，與煙草葉綠體基因組DNA

8、的148bp片段有98％的相似性。此結(jié)果顯示不育系和保持系葉綠體基因組間存在差異，此差異也許與Pol胞質(zhì)雄性不育相關(guān)。 5.不結(jié)球白菜溫敏型胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因的克隆及其表達分析 根據(jù)GenBank中Brassica rapa的orf224和atp6基因的保守序列設(shè)計特異引物對不結(jié)球白菜溫敏型(Pol)胞質(zhì)雄性不育系的基因組DNA進行特異擴增，獲得了Pol胞質(zhì)雄性不育的特異基因orf224c和atp6c的DNA序列。用t

9、Blastx在GenBank中進行相似性比對分析，發(fā)現(xiàn)不結(jié)球白菜orf224和atp6c基因與已報道的orf224和atp6基因的相似性高達100％，在GenBank中的登錄號依次為DQ400846、DQ412559。運用半定量RT-PCR對orf224c和基因在不同器官中的表達水平進行分析，結(jié)果表明：不育系花期葉片中該基因的表達量比幼蕾(長度小于0.5mm)和雄蕊中的明顯低，在幼蕾和雄蕊中的表達量無明顯差異；而在保持系的上述3個器官中

10、的orf24c基因表達量無明顯差異。該結(jié)果顯示orf24c基因表達上調(diào)與孢原細胞分化受阻相關(guān)。 6.不結(jié)球白菜溫敏型胞質(zhì)雄性不育系及其保持系蕾期基因表達差異的SRAP分析 用新型DNA指紋技術(shù)SRAP對不結(jié)球白菜溫敏型(Pol)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系蕾期基因的差異表達進行研究，在30對SRAP物對不育系和保持系cDNA的擴增產(chǎn)物中，不育系有2條穩(wěn)定的特異片段。對特異片段克隆測序分析發(fā)現(xiàn)，BccMS1與大白菜控制細胞生成