白菜雄性不育相關(guān)新基因BcMF1的克隆和功能驗(yàn)證.pdf

1、蕓薹屬是十字花科植物的重要類群，也是我國(guó)栽培面積最大的蔬菜作物。白菜(Brassica campestrisL.ssp.chinensis Makino)是蕓薹屬蕓薹種的一個(gè)亞種，是典型的異花授粉作物，具有顯著的雜種優(yōu)勢(shì)，F(xiàn)1代雜種的推廣應(yīng)用可以提高白菜的生產(chǎn)水平。雄性不育材料在白菜F1代種子的生產(chǎn)中具有重要地位，其選育和利用日益受到人們的重視。以白菜雄性不育材料為基礎(chǔ)，分析雄性不育相關(guān)基因的表達(dá)特征，分離雄性不育相關(guān)基因并驗(yàn)證基因的功

2、能，不僅可以促進(jìn)白菜雄性不育材料的選育，而且對(duì)于揭示植物雄性不育的分子機(jī)制也具有重要的理論意義。 本文以‘矮腳黃’白菜隱性核雄性不育兩用系為研究對(duì)象，在前人獲得雄性不育相關(guān)新基因Brassica campestris Male Fertility 1(BcMF1)的cDNA拼接序列的基礎(chǔ)上，通過PCR進(jìn)一步克隆BcMF1的DNA全長(zhǎng)和cDNA全長(zhǎng)；通過TAIL PCR技術(shù)克隆該基因的啟動(dòng)子序列；對(duì)BcMF1及其啟動(dòng)子的序列特征以

3、及編碼蛋白的功能進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)；并在幾種蕓薹屬植物中進(jìn)行BcMF1同源基因的克隆和進(jìn)化分析。為驗(yàn)證BcMF1的功能，構(gòu)建了RNA干涉(RNAi)和反義RNA植物表達(dá)載體，在分析菜心BcMF1同源基因表達(dá)特征的基礎(chǔ)上，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化菜心植株，獲取BcMF1表達(dá)沉默的卡那霉素抗性植株，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的花粉發(fā)育狀態(tài)進(jìn)行觀察，深入分析BcMF1在白菜花粉發(fā)育中的生物學(xué)功能。本研究獲得的主要結(jié)果如下： (1)根據(jù)表達(dá)差異片段BcMF-

4、A15T17及其RACE擴(kuò)增序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增得到BcMF1準(zhǔn)確的cDNA全長(zhǎng)和DNA全長(zhǎng)序列，cDNA全長(zhǎng)為1684 bp，基因全長(zhǎng)為1985 bp，含有兩個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，最大開放閱讀框?yàn)?416 bp，預(yù)測(cè)該基因可編碼一個(gè)含有471個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。不計(jì)算70 bp的3’末端A/T豐富序列和polyT尾部結(jié)構(gòu)，前人所得到的cDNA拼接序列為1613 bp，最大開放閱讀框?yàn)?344 bp，預(yù)期可編碼一個(gè)含有447個(gè)氨基酸的

5、蛋白質(zhì)。本文的結(jié)果校正了前人cDNA拼接序列及其預(yù)測(cè)的氨基酸序列的誤差。在GeneBank中沒有發(fā)現(xiàn)與BcMF1同源性較高的功能已知基因，BcMF1僅與擬南芥未知功能蛋白家族DUF1216的相似性較高，是第一個(gè)被報(bào)導(dǎo)的DUF1216表達(dá)基因，蛋白質(zhì)特征分析顯示BcMF1基因編碼蛋白很可能是一個(gè)定位在細(xì)胞外的分泌蛋白。 (2)以兩用系的可育株群和不育株群為研究對(duì)象，使用Northern雜交的方法較全面地分析了BcMF1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特

6、征，結(jié)果顯示BcMF1僅在可育株系的中花蕾、大花營(yíng)、花以及雄蕊中特異表達(dá)，在不育株系中不表達(dá)。因此，BcMF1是一個(gè)與白菜育性相關(guān)的新基因。 (3)通過PCR在不育株中擴(kuò)增了BcMF1序列，通過TAIL PCR在兩用系可育株和不育株中同時(shí)擴(kuò)增了該基因的啟動(dòng)子序列，從DNA水平上探討該基因表達(dá)差異形成的分子機(jī)理。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)BcMF1及其啟動(dòng)子序列在可育株和不育株中沒有出現(xiàn)變異，表明該基因的這種表達(dá)差異不是因?yàn)榛蚧騿?dòng)子序列突變

7、所引起的，推測(cè)BcMF1的表達(dá)受其他基因的調(diào)控。在BcMF1啟動(dòng)子序列中，發(fā)現(xiàn)了一些與光誘導(dǎo)響應(yīng)、激素響應(yīng)和脅迫響應(yīng)有關(guān)的順式作用元件，推測(cè)BcMF1的表達(dá)可能受到光條件、內(nèi)外源激素以及逆境脅迫的影響 (4)根據(jù)BcMF1的全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)引物，在7種蕓薹屬蔬菜作物中克隆到BcMF1的同源序列，BcMF1同源基因在核苷酸水平和氨基酸水平相似性分別為97.8％～99.6％和95.3％～98.9％。以同源基因的多序列比對(duì)為基礎(chǔ)，對(duì)7種蕓

8、薹屬蔬菜作物的BcMF1同源基因進(jìn)行系統(tǒng)分析，揭示了BcMF1同源基因在這些蔬菜作物中的進(jìn)化關(guān)系。 (5)克隆了菜心BcMF1同源基因并分析其表達(dá)特征，證明了菜心適用于白菜BcMF1的功能分析。構(gòu)建了RNA干涉表達(dá)載體pBcMF1-RNAi和反義RNA表達(dá)載體pBcMF1-AS，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化菜心，獲得了Kan抗性菜心植株。分子檢測(cè)表明已得到了BcMF1-AS轉(zhuǎn)基因植株和BcMF1-RNAi轉(zhuǎn)基因植株，Northern雜交顯示

9、BcMF1的表達(dá)在轉(zhuǎn)基因植株中受到抑制。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)狀況、花器官發(fā)育、花粉形態(tài)、花粉離體萌發(fā)率以及花粉發(fā)育過程進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)抑制BcMF1的表達(dá)可以影響菜心植株的花粉發(fā)育，因此推論BcMF1是一個(gè)與白菜花粉發(fā)育相關(guān)的新基因。 (6)根據(jù)pBI121質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)兩側(cè)的DNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)通用引物，以幾種pBI121表達(dá)載體及其轉(zhuǎn)基因植株為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并使用限制性內(nèi)切酶BamHI酶切分析來驗(yàn)證擴(kuò)增條帶的真實(shí)性，檢測(cè)結(jié)果