白菜花粉發(fā)育相關(guān)基因BcMF3和BcMF4的轉(zhuǎn)基因功能驗證.pdf

1、蕓薹屬(Brassica)植物是雜種優(yōu)勢利用最為普遍的作物種類之一，其雄性不育的機理及雄性不育系選育的研究一直深受重視。但是，雄性不育產(chǎn)生的機制仍然是一個尚未完全解開之謎，還有許多問題需要深入研究。在國家自然科學(xué)基金委和浙江省科技廳的資助下，本實驗室在前一階段利用mRNADD-PCR、cDNA-AFLP技術(shù)結(jié)合RACE技術(shù)，從普通白菜(B.campestrisssp.chinensis(L.)Makinovar.communisTsen

2、etLee)核雄性不育兩用系中成功分離得到了與白菜核雄性不育相關(guān)基因CYP86MF、BcMF1、BcMF2、BcMF3和BcMF4。對其中的BcMF3和BcMF4基因的RT-PCR分析表明，它們都只在普通白菜兩用系可育株系的中蕾和大蕾中特異表達。為進一步了解BcMF3和BcMF4基因的生物學(xué)功能，將普通白菜花蕾按大小進行更細分級，首先采用Northern雜交分析對BcMF3和BcMF4在白菜中的表達特征進行了進一步的確認；接著構(gòu)建了這兩

3、個基因的組成型啟動子CaMV35S的和絨氈層組織特異性啟動子A9的反義RNA和RNA干涉基因沉默植物表達載體；然后將所構(gòu)建的載體，采用FloralDip法轉(zhuǎn)化擬南芥(Arabidopsisthdiana)，通過組織培養(yǎng)途徑轉(zhuǎn)化與普通白菜同屬于白菜亞種的菜心(B.campestrisssp.chinensis(L)Makinovar.parachinensis(Bailey)TsenetLee)，獲得了擬南芥3個載體的共12株轉(zhuǎn)基因植株、

4、菜心10個載體的共148個轉(zhuǎn)基因植株株系；隨后對轉(zhuǎn)基因擬南芥和菜心植株的花粉形態(tài)、花粉萌發(fā)率與活力、花粉管的伸長、果膠甲酯酶的酶活性及不同載體的轉(zhuǎn)化效率進行了觀察和檢測，取得結(jié)果如下： (1)采用Northernblot分析了BcMF3和BcMF4基因的表達特征。結(jié)果顯示，BcMF3基因只在普通白菜核雄性不育兩用系(‘ZUajh97-01’)可育株的直徑為1.1mm以上的花蕾中特異表達，并且在1.2～2.5mm的花蕾中強表達，而

5、在可育株＜1.2mm的花蕾、可育株的葉片和不育株的混合花蕾中均不表達；BcMF4基因在可育株1.2～2.5mm的花蕾中特異表達，而在可育株＜1.2mm和＞2.5mm的花蕾、可育株的葉片和不育株的混合花蕾中均不表達。表明BcMF3和BcMF4基因可能與白菜的花粉發(fā)育有關(guān)，而且主要作用在花粉成熟前后。 (2)構(gòu)建了BcMF3和BcMF4基因的組成型啟動子CaMV35S的和絨氈層組織特異性啟動子A9的反義RNA和RNA干涉基因沉默植物

6、表達載體共10個，并分別將它們導(dǎo)入了農(nóng)桿菌LBA4404菌株中。 (3)將所構(gòu)建的10個載體的農(nóng)桿菌菌液采用FloralDip法轉(zhuǎn)化擬南芥。通過卡那霉素篩選，得到了3個具有CaMV35S啟動子的載體pBI-B3、pBI-B4R和pBI-BB34的共12株抗性轉(zhuǎn)基因植株，PCR和Suothernblot分析證明外源基因成功整合到了這些轉(zhuǎn)基因植株的基因組中，同時說明FloralDip法轉(zhuǎn)化擬南芥確實具有方便、快捷和低成本的優(yōu)點。

7、 (4)通過組織培養(yǎng)途徑的農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化‘油青45’菜心，平均轉(zhuǎn)化頻率為1.017％，10個載體都獲得了卡那霉素抗性轉(zhuǎn)基因植株，共獲得抗性轉(zhuǎn)基因植株148個株系。分子鑒定結(jié)果表明，卡那霉素抗性轉(zhuǎn)基因植株的PCR陽性率高達97.73％，而PCR陽性轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交陽性率也高達95.12％。表明外源基因成功整合到了這些轉(zhuǎn)基因植株的基因組中。 (5)擬南芥轉(zhuǎn)基因植株與對照植株的花器官沒有差別，但花粉數(shù)量明顯少于對照

8、植株；載體pBI-B3、pBI-B4R和pBI-BB34的轉(zhuǎn)基因植株分別有47.8％、46.3％和51.4％的花粉表現(xiàn)為畸形，其畸形形態(tài)分別為花粉短小且有的畸形花粉上裂口、花粉空癟以及花粉空癟且少量花粉短??；3個載體的轉(zhuǎn)基因植株花粉萌發(fā)率分別為31.6％、32.7％和25.6％，都明顯低于對照植株的68.3％，而且pBI-B3載體的轉(zhuǎn)基因植株45.7％的花粉在萌發(fā)過程中花粉管爆裂。3個載體的轉(zhuǎn)基因植株都只有一部分花粉的花粉管能伸長。說明

9、可能BcMF3在花粉壁而BcMF4是在細胞質(zhì)或細胞器發(fā)育過程中起著重要作用，單獨沉默和同時沉默BcMF3和BcMF4基因都能影響擬南芥的花粉發(fā)育和花粉管的伸長，從而能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株的部分花粉敗育。 (6)在所獲得的菜心轉(zhuǎn)基因植株中，在A9啟動子的5個載體的轉(zhuǎn)基因植株中，所觀察和測定的指標與對照沒有差別，證明BcMF3和BcMF4基因不是在絨氈層表達的。CaMV35S啟動子的5個載體的轉(zhuǎn)基因植株中，均有部分植株的部分花粉畸形，pB

10、I-B3、pBI-B4、pBI-B3R、pBI-B4R和pBI-BB34的花粉畸形率分別為100％、43.7％、100％、45.8％和100％，畸形表現(xiàn)為空癟或短小，其中pBI-BB34的短小畸形和空癟畸形的比例分別為64.5％和35.5％。具有畸形花粉的5個載體的轉(zhuǎn)基因植株的花粉萌發(fā)率分別為34.1％、24.7％、32.3％、23.7％和16.7％，但是沒有發(fā)現(xiàn)象擬南芥花粉管爆裂的現(xiàn)象。具有畸形花粉的pBI-B4和pBI-B4R的轉(zhuǎn)基

11、因植株無生活力的比例分別占29.7％和36.5％，而pBI-B3、pBI-B3R和pBI-BB34的轉(zhuǎn)基因植株無生活力的比例難以確定。具有畸形花粉的pBI-B3、pBI-B3R和pBI-BB34的轉(zhuǎn)基因植株的PME活性都比對照低。BcMF3和BcMF4基因的反義RNA載體的沉默效率比其RNA干涉載體的沉默效率分別低18.7％和30.6％；而BcMF3和BcMF4基因的反義RNA載體的沉默效率相差10.3％、RNA干涉載體的沉默效率相差2

12、2.2％。以上結(jié)果說明，BcMF3在花粉壁而BcMF4是在細胞質(zhì)或細胞器發(fā)育過程中起作用，單獨沉默和同時沉默BcMF3和BcMF4基因都能影響菜心的花粉發(fā)育，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株的部分花粉敗育；盡管沉默BcMF3和BcMF4基因都能導(dǎo)致部分花粉的不育，但是其不育的原因和機制可能不同，其花粉發(fā)育過程及其雄性不育的發(fā)生是很復(fù)雜的，可能與多基因的協(xié)調(diào)作用有關(guān)；反義RNA技術(shù)只是比RNA干涉技術(shù)的沉默基因效率低，即前者較難發(fā)生，但是沉默一旦.發(fā)生