白菜三種雄性不育系與保持系花蕾轉(zhuǎn)錄組差異分析及三個花粉發(fā)育相關(guān)基因功能鑒定.pdf

1、利用植物雄性不育特性來選育雄性不育系是作物雜種優(yōu)勢利用中簡化制種程序、降低制種成本的重要手段。十字花科作物是雜種優(yōu)勢利用最為普遍的一類作物，雄性不育系(簡稱不育系)是其生產(chǎn)一代雜種的理想系統(tǒng)。但植物雄性不育產(chǎn)生的機(jī)理極其復(fù)雜，至今尚未完全解開?；ǚ蹟∮侵参镄坌圆挥l(fā)生的表型體現(xiàn)，弄清花粉發(fā)育的全過程和分子機(jī)理是研究雄性不育的基礎(chǔ)和關(guān)鍵所在?；ǚ郯l(fā)育涉及眾多基因的表達(dá)調(diào)控，從轉(zhuǎn)錄組入手分析花粉發(fā)育突變體是獲得花粉基因動態(tài)表達(dá)的途徑之一，

2、并可獲得較大數(shù)目的花粉發(fā)育相關(guān)基因，有助于在整體水平上理解花粉發(fā)育的特征和花粉發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制。本文在獲得共享同一保持系(核不育兩用系的可育株系)的白菜(syn．B．rapa ssp．chinensis)‘矮腳黃’核不育(ajhGMS)兩用系‘Bcajh97-01A/B’、‘Polima’核質(zhì)互作不育(polG-CMS)系‘Bcp0197-05A’以及‘Ogura’細(xì)胞質(zhì)不育(oguCMS)系‘Bcogu97-06A’材料體系的基礎(chǔ)上

3、，采用擴(kuò)增互補(bǔ)脫氧核糖核酸片斷長度多態(tài)性(cDNA—AFLP)及擬南芥基因芯片分析其花蕾轉(zhuǎn)錄組差異，對花粉基因表達(dá)譜進(jìn)行系統(tǒng)分析，研究不同雄性不育遺傳模式的基因突變導(dǎo)致下游系列基因表達(dá)變化的異同，為建立不同雄性不育遺傳模式植物花粉基因表達(dá)譜的基本框架奠定基礎(chǔ)，并鑒定出一批白菜花粉發(fā)育相關(guān)基因。進(jìn)而采用反義RNA或RNA干涉技術(shù)，對細(xì)胞壁合成與調(diào)控相關(guān)的兩個多聚半乳糖醛酸酶基因BcMF2和BcMF9，以及一個未知功能的新基因BcMF10進(jìn)

4、行功能驗(yàn)證，從形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞學(xué)等方面入手鑒別三個基因在白菜花粉發(fā)育過程中的作剛機(jī)制。同時(shí)，從基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)特點(diǎn)、作用方式等方面，比較了白菜花粉表達(dá)的PG基因家族成員BcMF2、BcMF9和BcMF6的異同。取得的主要結(jié)果如下： (1)形態(tài)和細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)‘Bcajh97-01A’為雄性減數(shù)分裂的胞質(zhì)分裂突變體mmc，對應(yīng)基因MMC可能編碼特異作用于雄性減數(shù)分裂的蛋白質(zhì)。形態(tài)和細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，ajhGMS兩用系不育株系‘

5、Bcajh97-01A’與可育株系‘Bcajh97-01B’的差異僅表現(xiàn)在花粉花藥發(fā)育上，‘Bcajh97-01A’小孢子在減數(shù)分裂末期的胞質(zhì)分裂中出現(xiàn)異常，不能形成胞間壁而導(dǎo)致四分體形成及后續(xù)的花粉發(fā)育各過程受阻，最終引起花粉敗育。遺傳學(xué)分析表明該不育性狀由單基因位點(diǎn)控制，因此，‘Bcajh97-01A’實(shí)際上是一個受單基因位點(diǎn)控制的雄性減數(shù)分裂的胞質(zhì)分裂突變體mmc，其對應(yīng)基因MMC可能編碼一個特異與雄性減數(shù)分裂核分裂完成后的胞質(zhì)分

6、裂相關(guān)的蛋白質(zhì)。 (2)利用cDNA-AFLP技術(shù)結(jié)合擬南芥基因芯片分析白菜不同不育系之間及與其共同保持系之間的花蕾轉(zhuǎn)錄組差異，發(fā)現(xiàn)不同遺傳模式不育系花蕾基因表達(dá)有相似之處，但不盡相同。利用cDNA-AFLP技術(shù)及擬南芥ATH1基因芯片，對白菜ajhGMS‘Bcajh97-01A’、DolG-CMS‘Bcpo197-05A’和oguCMS‘Bcogu97-06A’，以及它們共同的保持系‘Bcajh97-01B’進(jìn)行了花蕾轉(zhuǎn)錄組比

7、較分析，發(fā)現(xiàn)不同的不育基因作用下均引起花蕾正常轉(zhuǎn)錄組的巨火變化，不育基因下游眾多基因的表達(dá)受到抑制，也有相當(dāng)一部分的基因被激活或表達(dá)上升，但作用的不育基因不同，引起的下游基因表達(dá)變化也不盡相同。與同一保持系‘Bcajh97-01B’相比，檢測到在‘Bcajh97-01A’花蕾中上調(diào)表達(dá)基因93個、下調(diào)表達(dá)基因158個：在‘Bcp0197-05A’花蕾中上調(diào)表達(dá)基因174個、下調(diào)表達(dá)基因212個；在‘Bcogu97-06A’花蕾中上調(diào)表達(dá)

8、基因196個、下調(diào)表達(dá)基因242個。其中，在三種不育系中共同下調(diào)表達(dá)的基因有37個，上調(diào)表達(dá)的24個：‘Bcajh97-01A’和‘Bcp0197-05A’共同下調(diào)和共同下調(diào)表達(dá)的基因各5個；‘Bcajh97-01A’和‘Bcogu97-06A’共同下調(diào)表達(dá)基因?yàn)?0個，共同上調(diào)表達(dá)基因9個；‘Bcp0197-05A’和‘Bcogu97-06A’共同下調(diào)表達(dá)基因70個，共同上調(diào)表達(dá)的基因45個。 (3)通過差異表達(dá)基因功能分類，

9、發(fā)現(xiàn)許多花粉花藥發(fā)育相關(guān)基因功能未知，白菜不同不育系與保持系的花蕾轉(zhuǎn)錄組差異分析擴(kuò)充了植物花粉表達(dá)或特異表達(dá)基因的數(shù)目。對在三種不育系與其共同保持系花蕾轉(zhuǎn)錄組中檢測到的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類，發(fā)現(xiàn)約50％的基因功能未知。基于三種不育系和保持系花蕾的差別僅表現(xiàn)在花藥發(fā)育和花粉形成上，在不育系和保持系花蕾中差異表達(dá)的基因最可能與花粉花藥發(fā)育相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)的這些差異表達(dá)基因在一定程度上擴(kuò)充了植物花粉花藥表達(dá)和特異表達(dá)基因的數(shù)目。 (

10、4)基于基因功能分類對不同不育系與保持系花蕾基因表達(dá)差異進(jìn)行的分析表明，不同遺傳模式花粉花藥轉(zhuǎn)錄組盡管具有相似的模塊，但具有不同的組成特征。對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類發(fā)現(xiàn)，不育系與保持系差異表達(dá)的三組基因可分為大致相同的功能類別，但每一功能類別在每組差異基因中所占的比例不盡相同。在三種不育系花蕾中下調(diào)均較多的已知功能的基因與轉(zhuǎn)運(yùn)通道、蛋白質(zhì)代謝、電子傳遞和能量途徑、防衛(wèi)和脅迫反應(yīng)相關(guān)，上調(diào)均較多的基因與轉(zhuǎn)運(yùn)通道、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和普通新陳代謝相

11、關(guān)。除此之外，‘Bcajh97-01A’與‘Bcogu97-06A’在花粉花藥基因表達(dá)上具有更大的共性，在兩者花蕾中均下調(diào)表達(dá)的基因中，細(xì)胞壁合成與調(diào)控基因排在第一位，細(xì)胞骨架蛋白及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因也占了較大的比例，而轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因的比例較?。簝烧呦抡{(diào)表達(dá)的基因中，蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因均比較多?！瓸caih97-01A’與‘Bcogu97-06A’的花蕾轉(zhuǎn)錄組的組成特征與擬南芥花粉轉(zhuǎn)錄組特征較一致。相比之下，‘Bcp0197-05A’花蕾轉(zhuǎn)

12、錄組的組成成分與其他兩種不育系有較大的差別。 (5)時(shí)空表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)三種不育系與其共同保持系花蕾差異表達(dá)的基因具不同的表達(dá)動態(tài)。對27條在三種不育系和保持系花蕾中差異表達(dá)的片段進(jìn)行了時(shí)空表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)差異片段所代表的基因表達(dá)在小孢子有絲分裂前后開始被檢測到，在花粉成熟過程中繼續(xù)積累，但在不同組織和發(fā)育階段中的表達(dá)水平不盡相同。此外也有在花粉發(fā)育早期就檢測到表達(dá)的基因。我們的研究結(jié)果證實(shí)了花粉花藥發(fā)育中的基因表達(dá)調(diào)控

13、是極其復(fù)雜的。在花粉花藥發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)或不表達(dá)，以及表達(dá)水平有序地發(fā)生變化都是與花粉花藥正常發(fā)育、實(shí)現(xiàn)其功能所需相對應(yīng)的。 (6)表達(dá)和功能分析發(fā)現(xiàn)BcMF2可能是一個與花粉內(nèi)壁發(fā)育相關(guān)的新PG基因。對本實(shí)驗(yàn)室前期從‘Bcajh97-01B’花蕾中分離得到的PG基因BcMF2進(jìn)行時(shí)空表達(dá)模式分析，發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄本最早在四分體時(shí)期的花蕾中開始出現(xiàn)，隨后在單核花粉粒時(shí)期的花蕾中表達(dá)量達(dá)到最高，之后，隨著花粉發(fā)育的進(jìn)行表達(dá)量逐漸降低直

14、至花粉成熟，表明其屬于花粉表達(dá)“早期”基因。利用反義RNA技術(shù)研究．BcMF2的功能，發(fā)現(xiàn)BcMF2表達(dá)受抑制的轉(zhuǎn)基因植株花粉體外正常萌發(fā)率大幅度降低。約80％的花粉管生長到一定程度后頂端膨大形成泡狀結(jié)構(gòu)，花粉管能穿過柱頭組織，但在花柱道中的生長停止。進(jìn)一步觀察顯示轉(zhuǎn)基因植株花粉畸形，萌發(fā)溝的數(shù)目及分布不規(guī)則，萌發(fā)溝在形成過程中位置和數(shù)目紊亂，花粉粒內(nèi)壁異常增厚。推測BcMF2表達(dá)受抑制影響了花粉內(nèi)壁中果膠的動態(tài)代謝平衡而導(dǎo)致萌發(fā)溝及花

15、粉粒內(nèi)壁發(fā)育的異常。BcMF2與已知的在花粉發(fā)育早期起作用的PG基因沒有序列及表達(dá)特點(diǎn)的相似性，因此它可能是一個新的在花粉發(fā)育早期表達(dá)的PG基因。 (7)表達(dá)和功能分析發(fā)現(xiàn)分離獲得的另一個白菜PG基因BcMF9可能參與花粉內(nèi)肇和外壁的發(fā)育。分離獲得在可育株‘Bcajh9701B’花蕾中特異表達(dá)的差異片段BBS13/BPO023的全長序列BcMF9，發(fā)現(xiàn)該基因具有典型的PG基因結(jié)構(gòu)特征。分子進(jìn)化分析表明其屬于花粉表達(dá)或特異表達(dá)的P

16、G基因類群。時(shí)空表達(dá)模式分析顯示BcMF9屬于花粉表達(dá)“晚期”基因,因其表達(dá)最早出現(xiàn)在四分小孢子中，在單核小孢子中開始增強(qiáng)，然后一直持續(xù)較高水平的表達(dá)直到花粉成熟。BcMF9的轉(zhuǎn)錄本亦在絨氈層中出現(xiàn)，從四分體時(shí)期開始直到絨氈層降解退化，一直在絨氈層細(xì)胞中維持很強(qiáng)的表達(dá)信號。轉(zhuǎn)反義BcMF9的植株花粉離體止常萌發(fā)率明顯降低，約81％的花粉萌發(fā)時(shí)花粉管爆裂?；ǚ酃苣艽┻^柱頭組織，但不久便停止生長。掃描電鏡和透射電鏡觀察顯示，BcMF9表達(dá)受

17、抑制產(chǎn)生外壁網(wǎng)紋淺的畸形花粉，花粉粒萌發(fā)溝處內(nèi)壁增厚異常，萌發(fā)溝的位置和數(shù)目紊亂，花粉發(fā)育晚期外壁的覆蓋層和基粒棒部分脫落，含油層外溢，說明BcMF9可能參與花粉壁的發(fā)育。 (8)比較分析發(fā)現(xiàn)PG基因家族成員BcMF2、BcMF6和BcMF9在花粉發(fā)育中可能扮演各自不同的角色。從基因序列特征、表達(dá)模式特點(diǎn)、基因進(jìn)化關(guān)系及生物學(xué)功能等方面比較三個花粉發(fā)育相關(guān)的PG基因BcMF2、BcMF6和BcMF9的異同，發(fā)現(xiàn)盡管3個PG基因的

18、表達(dá)所出現(xiàn)的發(fā)育階段一致，但三者在各個發(fā)育階段的表達(dá)量及表達(dá)變化的趨勢各不相同。三者在十字花科物種中的進(jìn)化特點(diǎn)也不完全一致。3個PG基因的表達(dá)受抑制引發(fā)了類似的結(jié)果，但并不盡相同，說明它們在花粉發(fā)育中所起的作用及作用模式可能各異。 (9)分離獲得在‘Bcajh97-01B’和‘Bcp0197-05A’花蕾中高水平表達(dá)的基因BcMF10，序列特征分析提示其可能與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)，RNAli研究發(fā)現(xiàn)BcMF10表達(dá)受抑制導(dǎo)致花粉萌發(fā)