Fostriecin生物合成相關(guān)基因功能的研究.pdf

1、福司曲星（Fostriecin，F(xiàn)ST）是由鏈霉菌Streptomyces pulveraceus產(chǎn)生的一種磷酸酯類聚酮化合物，具有良好的抗腫瘤活性。FST的生物合成是由Ⅰ型聚酮合酶催化形成，其后經(jīng)過一系列后修飾加工反應，如:羥基化、磷酸化等。目前，對FST的研究主要針對其生物活性及化學合成方面。不同鏈霉菌遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的難易程度不同，F(xiàn)ST產(chǎn)生菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系較難建立，至今未見FST產(chǎn)生菌遺傳轉(zhuǎn)化體系和生物合成機制的相關(guān)報道。本研究

2、建立并優(yōu)化了FST產(chǎn)生菌S.pulveraceus的遺傳轉(zhuǎn)化體系;通過基因阻斷失活，確定了FST生物合成后修飾基因的功能;初步確定了FST生物合成的PKS后修飾途徑。主要研究內(nèi)容包括：
　　⑴利用接合轉(zhuǎn)移方法建立并優(yōu)化了FST產(chǎn)生菌S.pulveraceus的遺傳轉(zhuǎn)化體系。最適宜的轉(zhuǎn)化條件為:以孢子懸液作為受體菌，50℃熱激10 min，涂布于添加終濃度為5％甘氨酸的MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)18h后，用終濃度為20μg/mL的阿伯拉霉素和

3、25μg/mL的萘啶酮酸覆蓋。
　?、茖ed/ET重組系統(tǒng)的電轉(zhuǎn)體系進行優(yōu)化，提高了同源重組效率。具體的參數(shù)為:電轉(zhuǎn)時加入500 ng外源線性DNA，制備感受態(tài)細胞時大腸桿菌培養(yǎng)至OD600值為0.4～0.6，感受態(tài)細胞的終濃度為0.7×107個/μL，添加的L-阿拉伯糖終濃度為20 mmol/L，誘導3h。
　?、歉鶕?jù)FST基因簇上與其生物合成相關(guān)的基因序列進行BLAST同源比對分析，發(fā)現(xiàn)FST生物合成基因簇含有5個主要

4、后修飾基因，被命名為fosG、fosJ、 fosK、fosH和fosM。為了研究它們各自的功能，通過基因阻斷試驗對基因進行失活。與野生型菌株相比，fosG阻斷變株不再產(chǎn)化合物PD113271，以FST為主要產(chǎn)物;fosJ阻斷變株產(chǎn)生五種新衍生物(1～5);fosH阻斷變株產(chǎn)生兩種新衍生物(6，7);fosK阻斷變株產(chǎn)生兩種新衍生物(8，PD113270);而fosM基因缺失突變株只產(chǎn)生一種新衍生物(9)。經(jīng)質(zhì)譜和核磁對新衍生物的結(jié)構(gòu)進行

5、解析，初步證實了這5個后修飾基因的功能。fosG、fosJ、 fosK編碼細胞色素P450單氧化酶，屬于羥化酶，分別修飾FST C-4、C-8及C-18位的羥基化;FosH屬于磷酸激酶家族成員，參與FST C-9位的磷酸化;fosM基因負責脫去C-3位丙二酸酯形成FST C2，C3位之間的不飽和雙鍵。
　　⑷通過基因互補試驗，確定基因缺失突變株的代謝產(chǎn)物不是由其它因素影響的。以pSET153-tsr為出發(fā)質(zhì)粒，連入目的基因構(gòu)建基因

6、回復載體，分別轉(zhuǎn)入相應的基因阻斷突變株中，得到回復菌株。對其進行搖瓶發(fā)酵，HPLC分析顯示:基因在其阻斷變株中獲得表達，fosJ～fosM回復菌株重新合成FST，fosG回復菌株重新積累到化合物PD113271。
　　⑸多數(shù)聚酮化合物的結(jié)構(gòu)中包含一個或多個雙鍵，這些雙鍵是由PKS模塊中酮還原酶-脫水酶(KR-DH)雙結(jié)構(gòu)域催化形成，但FST PKS最后一個模塊缺少DH結(jié)構(gòu)域，無法形成內(nèi)酯環(huán)的不飽和雙鍵。通過對fosM基因功能的研究

7、，發(fā)現(xiàn)該不飽和雙鍵的形成不依賴于PKS模塊脫水酶(DH)結(jié)構(gòu)域，由后修飾基因fosM完成。FST生物合成的整個PKS后修飾過程均伴隨著C-3位丙二酸酯結(jié)構(gòu)進行，只有當FosK催化形成C-18位羥基后，F(xiàn)osM才發(fā)揮功能作為FST合成的最后一步脫去丙二酸形成不飽和內(nèi)酯。
　?、矢鶕?jù)5個后修飾基因阻斷試驗得到的一系列衍生物結(jié)構(gòu)分析，初步確定了FST生物合成的PKS后修飾途徑。帶有丙二酸酯結(jié)構(gòu)的化合物4經(jīng)FosJ羥化，加載C-8位羥基，