Paget骨病家系相關(guān)基因篩查及候選基因功能研究.pdf

1、Paget骨病是一種慢性進(jìn)行性的代謝性骨病，以過(guò)度紊亂的骨更新為特征，可引起骨痛、骨畸形、導(dǎo)致病理性骨折及其他并發(fā)癥，病變可累及全身一處或多處骨骼，以中軸骨和承重的四肢骨多見(jiàn)。病灶處發(fā)現(xiàn)巨大多核的破骨細(xì)胞增多，且活性增強(qiáng)。Paget骨病分為散發(fā)性和家族性，在西歐、北美等地區(qū)多見(jiàn)。該病的發(fā)病機(jī)制還未完全清楚，普遍認(rèn)為環(huán)境因素與遺傳因素共同影響該疾病的發(fā)生。在新西蘭、澳大利亞和南非等國(guó)家中，來(lái)自高患病率地區(qū)的移民Paget骨病患病率明顯高于

2、本地人。Paget骨病患病率在種族上的差異性及家族性聚集性提示遺傳因素在其發(fā)病機(jī)制中有重要作用。Paget骨病患者往往有陽(yáng)性家族史，通常呈常染色體顯性遺傳，不完全外顯率較高。近年來(lái)，隨著分子遺傳學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對(duì)Paget骨病遺傳病因的研究不斷深入。新近研究發(fā)現(xiàn)，RANK/RANKL和NF-kB信號(hào)通路分子如SQSTM1/p62等基因突變與破骨細(xì)胞的異?；罨癙aget骨病的發(fā)生有關(guān)，但半數(shù)以上的該病患者未發(fā)現(xiàn)這些突變，提示其他基

3、因變異可能參與其發(fā)生發(fā)展。
　　 目的：
　　 在對(duì)Paget骨病家系進(jìn)行已知易感基因檢測(cè)的基礎(chǔ)上，利用全基因外顯子測(cè)序技術(shù)篩查相關(guān)基因突變，并對(duì)篩查的疾病候選基因ASB16及FKBP5基因進(jìn)行功能研究，探討其在Paget骨病發(fā)病的作用，為深入了解其發(fā)病的遺傳學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.SQSTM1及TNFRSF11A基因突變篩查:抽取家系成員外周血并提取全血基因組DNA，通過(guò)查閱文獻(xiàn)確定S

4、QSTM1及TNFRSF11A為該P(yáng)aget骨病家系的基因篩查的候選基因，針對(duì)兩個(gè)基因的全部外顯子分別設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物直接DNA測(cè)序，結(jié)果用軟件Sequencher5.0 Demo分析。
　　 2.ASB16基因啟動(dòng)子活性的研究:通過(guò)對(duì)患者全基因外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)ASB16基因5'端+27處G/C雜合性變異。通過(guò)對(duì)正常樣本測(cè)序篩查，統(tǒng)計(jì)ASB16基因待測(cè)位點(diǎn)在正常人群中基因型分布頻率。應(yīng)用啟動(dòng)子預(yù)測(cè)軟件確定包括該變

5、異位點(diǎn)的候選啟動(dòng)子區(qū)域，經(jīng)PCR擴(kuò)增活得該啟動(dòng)子基因片段，將基因片段插入pMD-18T克隆載體，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMD-18T/ASB16，通過(guò)菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆，通過(guò)DNA測(cè)序篩選突變型和野生型陽(yáng)性克隆質(zhì)粒。構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3/ASB16，NheⅠ，HindⅢ雙酶切pMD-18T/ASB16克隆載體，將切下回收ASB16基因啟動(dòng)子片段插入質(zhì)粒pGL3-basic中。在脂質(zhì)體的作用下，將重組的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL

6、3/ASB16與內(nèi)參照質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞HEK293，培養(yǎng)48小時(shí)后，通過(guò)檢測(cè)熒光素酶活性反應(yīng)啟動(dòng)子活性，結(jié)果用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0分析。
　　 3.人FKBP5基因的克隆表達(dá)及純化:通過(guò)對(duì)患者全基因外顯子測(cè)序，在FKBP5基因中發(fā)現(xiàn)G/C雜合性變異。為研究該突變對(duì)FKBP5功能的影響極其在Paget骨病發(fā)病中的作用，進(jìn)行野生型和突變型FKBP5表達(dá)的研究。針對(duì)目的基因片段設(shè)計(jì)引物，并加入NcoⅠ和BamHⅠ酶

7、切位點(diǎn)，C端加入6×His的His-Tag標(biāo)簽。通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得野生型和突變型的目的基因片段，插入pMD-18T克隆載體，構(gòu)建野生型及突變型的重組克隆質(zhì)粒pMD-18T/FKBP5，菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆，并DNA測(cè)序分析鑒定。分別構(gòu)建野生型及突變型的pET-11 d/FKBP5原核表達(dá)載體，重組克隆質(zhì)粒pMD-18T/FKBP5經(jīng)NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切，將瓊脂糖凝膠電泳分離純化的FKBP5基因片段插入雙酶切后的原核表達(dá)載體pET

8、-11d中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，菌落PCR及酶切分析鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒。分別將野生型和突變型的重組質(zhì)粒pET-11 d/FKBP5轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)菌株，挑取單克隆菌落培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE分析和Western blot鑒定重組蛋白。重組人FKBP5蛋白的純化，誘導(dǎo)表達(dá)的重組人FKBP5分別收集菌裂解上清和包涵體沉淀，做SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)形式，在非變性條件下，采用Ni2+-NTA親和層析法對(duì)目的蛋白進(jìn)

9、行純化，做SDS-PAGE分析目的蛋白的純度。
　　 結(jié)果：
　　 1.SQSTM1及TNFRSF11A基因突變篩查
　　 在該家系中未發(fā)現(xiàn)與Paget骨病共分離的致病基因突變，檢測(cè)到14個(gè)已知的單核苷酸多態(tài)性。提示SQSTM1及TNFRSF11A不是該家系的致病基因。
　　 2.ASB16基因啟動(dòng)子活性的研究
　　 2.1正常人群ASB16突變率的研究:正常樣本篩查結(jié)果ASB16基因待測(cè)位點(diǎn)基因

10、型GC頻率2.74％，基因型GG頻率97.26％，提示該變異為新發(fā)現(xiàn)的SNP。
　　 2.2熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建:PCR擴(kuò)增的ASB16基因候選啟動(dòng)子片段，電泳可見(jiàn)463bp處有明亮條帶，與設(shè)計(jì)一致。將ASB16基因候選啟動(dòng)子片段與線性克隆載體pMD-18T連接后，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)菌落PCR篩選及DNA測(cè)序鑒定，成功獲得了野生型及突變型的克隆載體pMD-18T/ASB16。分別將野生型和突變型ASB16基因候選啟動(dòng)子基因片

11、段插入熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-basic中，通過(guò)PCR和DNA測(cè)序鑒定正確，成功構(gòu)建了野生型和突變型的熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3/ASB16。
　　 2.3啟動(dòng)子活性檢測(cè):熒光素酶活性檢測(cè)，與陰性對(duì)照組相比，重組的熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3/ASB16熒光素酶活性升高(P＜0.05);野生型與突變型pGL3/ASB16相比，熒光素酶活性無(wú)顯著差異（P＞0.05）。提示該突變不影響ASB16啟動(dòng)子的活性，不是該家系致病基

12、因。
　　 3.人FKBP5基因的克隆表達(dá)及純化
　　 3.1表達(dá)載體的構(gòu)建:PCR擴(kuò)增的野生型及突變型FKBP5基因片段，電泳可見(jiàn)1400bp處有明亮條帶，與設(shè)計(jì)一致。分別將FKBP5基因片段與線性克隆載體pMD-18T連接后，轉(zhuǎn)化DH5α，經(jīng)菌落PCR篩選及DNA測(cè)序鑒定，成功獲得了野生型及突變型的克隆載體pMD-18T/FKBP5。通過(guò)NcoⅠ和BamHⅠ雙酶切克隆載體pMD-18T/FKBP5，將FKBP5基因片

13、段插入原核表達(dá)載體pET-11d中，并通過(guò)雙酶切和菌落PCR鑒定正確，成功構(gòu)建了野生型和突變型原核表達(dá)載體pET-11 d/FKBP5。
　　 3.2人FKBP5蛋白的表達(dá)鑒定及純化:野生型和突變型菌株經(jīng)擴(kuò)增、IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析，誘導(dǎo)后的重組菌株在52kD處出現(xiàn)明顯目的條帶，并且目的蛋白大部分以可溶性形式表達(dá)于菌體的超聲上清中。Western blot結(jié)果顯示重組蛋白與抗人FKBP5多克隆抗體和抗His-Tag單

14、克隆抗體均能發(fā)生特異性結(jié)合，表明獲得的重組蛋白為特異性FKBP5蛋白。非變性條件下，采用Ni2+-NTA親和層析法對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，進(jìn)行SDS-PAGE分析，F(xiàn)KBP5蛋白純度達(dá)到85％以上。
　　 結(jié)論：
　　 1.SQSTM1及TNFRSF11A不是該家系的致病基因:SQSTM1及TNFRSF11A的基因突變篩查中，在該家系中未發(fā)現(xiàn)與Paget骨病共分離的致病基因突變，檢測(cè)到14個(gè)已知的單核苷酸多態(tài)性，排除這兩個(gè)基

15、因?yàn)樵摷蚁礟aget骨病致病基因的可能性。
　　 2.ASB16基因上游新發(fā)現(xiàn)的SNP與該家系的發(fā)病無(wú)關(guān):成功構(gòu)建了野生型和突變型的熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3/ASB16，ASB16基因候選啟動(dòng)子有一定的啟動(dòng)活性，野生型與突變型啟動(dòng)活性無(wú)明顯差異，該位點(diǎn)的變異對(duì)ASB16基因的啟動(dòng)活性無(wú)顯著影響，提示新發(fā)現(xiàn)的SNP和Paget病的發(fā)病無(wú)關(guān)。
　　 3.人FKBP5蛋白的表達(dá)純化:成功構(gòu)建了野生型和突變型的人FKBP5基