高度近視定位候選基因的突變篩查.pdf

1、研究目的:該文根據(jù)定位克隆的相關(guān)位點(diǎn),選擇18p11.31上的3個(gè)基因:METTL4基因、CETN1基因和RAB31基因?yàn)楹蜻x篩查基因.篩查它們的所有編碼外顯子,尋找是否存在突變.若找到有意義突變,則進(jìn)行疾病連鎖分析、家系連鎖分析以及蛋白質(zhì)分析,進(jìn)一步明確此突變?yōu)楦叨冉暤闹虏⊥蛔?此基因?yàn)楦叨冉暤闹虏』?從而從基因水平闡明高度近視發(fā)病的分子機(jī)理,為高度近視的基因治療打下基礎(chǔ).材料與方法:1.研究對(duì)象為高度近視患者157例,其中常染

2、色體顯性遺傳家系先證者(AD組)59例;常染色體隱性遺傳家系先證者(AR組)46例;無(wú)明顯家系的散發(fā)患者(SF組)52例.經(jīng)散瞳驗(yàn)光確定雙眼屈光狀態(tài)超過(guò)-6.0D.對(duì)照組人群71例,無(wú)屈光不正或輕度屈光不正(不超過(guò)-1.5D).2.我們根據(jù)NCBI Mapviewer數(shù)據(jù)庫(kù)18p11.31區(qū)域內(nèi)基因的具體位置和基因的功能,選擇METTL4基因、CETN1基因和RAB31基因?yàn)槲覀兒Y查的候選基因.查找這3個(gè)基因的NCBI Locuslin

3、k、NCBI Sequence Viewer等網(wǎng)頁(yè)的信息,確定基因的結(jié)構(gòu),包括外顯子數(shù)目、長(zhǎng)度、是否編碼等等.根據(jù)相關(guān)信息設(shè)計(jì)并合成多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增的引物.3.抽提所有研究對(duì)象的外周血基因組DNA.然后以這些基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增METTL4基因、CETN1基因和RAB31基因的每一個(gè)編碼外顯子.對(duì)所有的PCR產(chǎn)物進(jìn)行異源雙鏈一單鏈構(gòu)象多態(tài)分析(HA-SSCP).對(duì)聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶存在差異的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和序

4、列測(cè)定.將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較,確定引起差異的堿基改變、位置以及蛋白質(zhì)改變.用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件X<'2>分析比較組間差異.結(jié)論:1.基本排除METTL4基因、CETN1基因和RAB31基因是高度近視的致病基因.2.METTL4基因編碼區(qū)的SNP17279 A→C在Genbank均未見(jiàn)報(bào)道.9972C→A與AR高度近視、SF高度近視無(wú)關(guān),與AD高度近視的發(fā)病可能有關(guān),需要進(jìn)一步確定.3.CETN1基因的編碼區(qū)的SNP1