關節(jié)攣縮癥基因突變篩查及致病機制的初步研究.pdf

1、背景和目的：關節(jié)攣縮癥（arthrogryposis），又稱多發(fā)性先天攣縮癥（multiple congenital contractures）是指出生后就存在兩個或者兩個以上的關節(jié)發(fā)生先天性多發(fā)關節(jié)攣縮，通常主要涉及到四肢，但也涉及到下巴，脖子和脊柱等部位。關節(jié)攣縮癥是一種臨床癥狀，而不是一種臨床疾病。這種攣縮癥狀通常是非進行性的，如果在早期進行及時合理的物理治療和護理可以改善病人的臨床癥狀?？傮w上講，關節(jié)攣縮癥的發(fā)生主要原因是因為在

2、胎兒懷孕期間由于中心神經(jīng)疾病，外周神經(jīng)疾病，肌肉疾病，結(jié)締組織疾病，胎兒空間缺乏，母體疾病，環(huán)境因素和血管損傷等，導致胎兒胎動減少引起的。目前發(fā)現(xiàn)超過400多種疾病都可能出現(xiàn)關節(jié)攣縮癥狀，這些疾病包括：基因突變，染色體重排，染色體缺失和重復等引起的疾病。其中有超過150多種單基因疾病都會存在關節(jié)攣縮癥，因此僅僅通過臨床癥狀對于該疾病確診比較困難。雖然關節(jié)攣縮癥是一種比較少見的臨床癥狀，但臨床上總的發(fā)病率高達1/3000-1/5000之間

3、，因此一個明確的診斷對于該類疾病的再發(fā)風險，患者的管理和疾病治療很重要。
　　方法：收集2014年9月至2016年12月間來我院進行遺傳咨詢的關節(jié)攣縮癥的病人，進行臨床咨詢、放射及超聲影像學檢查。應用全外顯子高通量測序技術對臨床診斷疑似關節(jié)攣縮癥的先證者進行基因突變篩查，根據(jù)臨床癥狀，進行生物學信息分析，初步確定可能的致病突變位點，采用 Sanger測序?qū)蚁党蓡T進行驗證，根據(jù)遺傳學共分離原則，最終確定家系的致病基因，對需要產(chǎn)前診

4、斷并且已經(jīng)明確致病突變位點的家系進行產(chǎn)前診斷。
　　為了探討關節(jié)攣縮癥的致病機制，我們對其中一個家系的TNNT3致病基因進行功能學分析。在簽署知情同意書的情況下，對該家系引產(chǎn)的關節(jié)攣縮胎兒進行組織樣本采集，采用 HE染色及電子顯微鏡觀察胎兒骨骼肌的肌小節(jié)和肌細胞的形態(tài)變化。同時構(gòu)建 TNNT3基因野生型及突變型真核表達載體，轉(zhuǎn)染 HEK293細胞，24小時后，采用熒光定量RT-PCR和Western blot技術檢測TNNT3基因

5、突變對表達水平的影響。
　　結(jié)果：對收集的8個關節(jié)攣縮病例進行全外顯子高通量測序，發(fā)現(xiàn)3例與疾病相關聯(lián)的致病位點，并且為其中的兩個家庭提供了產(chǎn)前診斷。
　　家系1：該家系共有3名患者，臨床癥狀均表現(xiàn)為雙手關節(jié)嚴重攣縮，尺側(cè)偏斜，屈曲指等癥狀，全外顯子組測序技術發(fā)現(xiàn)了一個已報到的熱點突變位點TNNT3基因c.187C>T(p.R63C)，對其胎兒羊水進行驗證發(fā)現(xiàn)，在懷孕第三次和第四次胎兒都攜帶該致病位點，在簽署知情下進行了引產(chǎn)

6、，結(jié)果胎兒的臨床癥狀和先癥者的癥狀相似，都存在手部遠端關節(jié)攣縮，屈曲指，扁平足等異常。同時我們收集了胎兒引產(chǎn)的肌肉組織標本，在病理水平上發(fā)現(xiàn)，胎兒骨骼肌結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變，尤其是電子顯微鏡下胎兒骨骼肌肌小節(jié)排列紊亂，出現(xiàn)纖維水腫和線粒體水腫等癥狀。在細胞水平上發(fā)現(xiàn)，與野生型細胞組和空細胞組相比在 RNA水平上，基因表達未發(fā)生明顯改變，但在蛋白水平上目的蛋白表達明顯提高。
　　家系2：該家系有5名患者，臨床表現(xiàn)為外耳廓異常，身材和四肢

7、修長，雙手手指纖細關節(jié)攣縮，不能自主伸展等癥狀。全外顯子組測序技術發(fā)現(xiàn)在FBN2基因存在 c.3344A>T（p.D1115V）一個新發(fā)突變，對其家庭 Sanger測序驗證發(fā)現(xiàn)該家系健康成員未攜帶該突變，有相似癥狀的患者都攜帶該突變。通過生物信息學分析該突變有著強致病性，其在該位點周圍存在多個突變位點，且該基因引起的癥狀和患者的癥狀相似，綜上所述該位點為該家系的致病位點。對先證者羊水驗證發(fā)現(xiàn)胎兒也攜帶該致病突變，對胎兒引產(chǎn)，結(jié)果胎兒臨床

8、表型和先證者表現(xiàn)相似，身材修長，遠端關節(jié)攣縮，手指屈曲，耳朵褶皺異常等癥狀。經(jīng)過先癥者及其家屬知情同意后，我們留取胎兒骨骼肌對其進行病理學觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胎兒骨骼肌線粒體水腫，纖維間也發(fā)生水腫，纖維間疏松。
　　家系3：該家系有2名患者，臨床癥狀表現(xiàn)：雙手十指攣縮，身材矮小，脊柱測凸，多關節(jié)翼狀贅皮等癥狀。經(jīng)全外顯子組測序技術在該家系內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個CHRNG基因c.715C>T純合突變，該突變?yōu)橐阎虏⊥蛔儭Ｍㄟ^Sanger測序驗證結(jié)果