2型腓骨肌萎縮癥家系新致病基因的篩查及發(fā)病機制研究.pdf

1、腓骨肌萎縮癥又稱為CMT，是最常見的遺傳性神經系統(tǒng)疾病，發(fā)病率約為1/2500。CMT在幼年及成年都可發(fā)病，患者常伴有四肢無力、四肢遠端肌肉進行性萎縮、足部骨骼畸形、輕度感覺受累等癥狀。CMT通常不致命，但由于患者運動功能受損，生活質量受到嚴重影響。根據患者的病理特點及運動神經元傳導速率，CMT可分為脫髓鞘型（CMT1，MNCV<38 m/s）、軸索型（CMT2，MNCV>38 m/s）和中間型（ICMT，25

2、三種類型。CMT具有明顯的遺傳異質性和臨床異質性特點。
　　到目前為止，已發(fā)現80多個基因的突變與CMT的發(fā)生相關，其中超過半數的致病基因都是在2009年外顯子組測序技術被應用后發(fā)現的。至今，超過90％的CMT1患者通過基因診查明了致病基因，然而CMT2患者中卻仍有25-43%沒有得到明確的基因診斷，即使在最新的臨床病例中，也仍有很多CMT2患者未能檢出致病基因。篩查CMT2新的致病基因，不僅有助于提高CMT2患者的檢出率，還有助

3、于CMT2發(fā)病機制地闡明，幫助CMT2患者采取更準確、有效的治療措施。
　　前期，我們實驗室在山東省發(fā)現了一個遺傳病家系，該家系連續(xù)三代均有發(fā)病患者。遺傳系譜圖分析，該家系疾病為常染色體顯性遺傳病。我們對該家系部分發(fā)病患者進行了全面的臨床檢查，檢查發(fā)現該家系患者四肢遠端肌肉萎縮，出現諸如爪形手、鶴形腿、高弓足、槌狀趾等CMT病癥。電生理檢查發(fā)現，患者正中神經和尺神經的運動神經元傳導速率輕度減慢（36-47 m/s），而各神經的復合

4、動作電位明顯降低；患者腓腸神經病理檢查發(fā)現，有髓神經纖維軸索發(fā)生明顯萎縮，出現空泡樣病變，少數髓鞘出現分層結構。經臨床診斷，該家系患者被確診為CMT2型。為明確該CMT2家系的發(fā)病原因，我們對該家系患者進行了CMT2常見致病基因的篩查，未發(fā)現常見致病基因發(fā)生突變。為尋找該家系遺傳病的致病基因，我們利用外顯子組捕獲與二代測序技術，對患者基因組進行了突變篩查，篩查獲得77個突變基因，共82個突變位點。然后，我們對山東CMT2家系成員基因組內

5、的這些位點一一進行了Sanger測序驗證，并進行了基因型與表型共分離分析，結果發(fā)現患者基因組中AFAP-120基因的第1621位發(fā)生錯義突變（c.1621C>T），其編碼蛋白第541位非極性脯氨酸被極性絲氨酸替代。在正常人群中對AFAP-120基因突變進行篩查，未發(fā)現相關突變。為檢測AFAP-120 c.1621C>T突變是否具有廣泛的普適性，在其他CMT2患者中也同樣存在，我們先后收集了148例CMT2患者基因組樣品，這些樣品均未發(fā)現

6、常見CMT2致病基因的突變。對這些患者AFAP-120基因所有的外顯子進行測序分析，遺憾的是并未發(fā)現c.1621C>T突變，但篩查到一個c.1738A>G（p.N580D）SNP位點。
　　人AFAP-120基因定位于4p16.1，其編碼蛋白是一個由814個氨基酸構成的微絲結合蛋白。AFAP-120蛋白是AFAP-110的剪接異構體，在結構上僅比AFAP-110多一個富含脯氨酸的NINS結構域。我們在CMT2患者中篩查獲得的點突變

7、P541S即位于NINS結構域內。AFAP-110在組織中廣泛表達，而AFAP-120僅在神經系統(tǒng)中特異表達。至今，沒有關于AFAP-120突變導致CMT2發(fā)生的文獻報道，對AFAP-120功能，尤其是NINS片段的功能也知之甚少。序列比對分析，人AFAP-120第541位脯氨酸在各物種中高度保守，提示該位點氨基酸在進化中可能發(fā)揮不可替代的功能。利用MutationTaster、PolyPhen-2等軟件對AFAP-120 c.1621

8、C>T（p.P541S）突變位點的致病性進行分析，結果顯示該位點突變具有很強的致病性（PolyPhen-2 HumVar model預測得分高達0.996）。
　　為進一步明確AFAP-120錯義突變c.1621C>T（p.P541S）與CMT2發(fā)生之間的因果關系，并探索該突變導致CMT2發(fā)生的具體機制，我們構建了AFAP-120 P542S轉基因小鼠模型，將小鼠AFAP-120蛋白對應于患者AFAP-120突變位點的脯氨酸替換為

9、絲氨酸。通過后續(xù)繁育與基因型鑒定，成功獲得點突變雜合及純合小鼠，并將雜合小鼠交配，繁殖獲得了不同基因型的同窩小鼠，用于后續(xù)行為學及神經病理學實驗。對轉基因小鼠進行滾軸、熱板、足跡等行為學評價，發(fā)現出生11個月后，雌性純合AFAP-120 P542S小鼠四肢感覺能力較野生型小鼠減弱；雄性純合AFAP-120 P542S小鼠出現步態(tài)失調。對小鼠外周神經進行了病理學實驗，發(fā)現AFAP-120發(fā)生突變后，部分雜合及純合小鼠，其腓淺神經有髓神經纖

10、維的軸索萎縮，出現大量空泡樣結構，平均橫切面積約減少30%；少數軸突伴有髓鞘病變，出現低片層結構。部分雜合及純合小鼠，其腓淺神經有髓神經纖維畸形，髓鞘增生，增厚或形成多個獨立而聚集的“龍卷風狀”結構，平均厚度分別增加約0.080μm、0.167μm；有髓神經纖維軸索不規(guī)則萎縮，平均橫切面積分別減少0.520μm2、4.429μm2；無髓神經纖維軸索萎縮，甚至消失；軸索中部分線粒體膨大，嵴消失，出現空泡狀改變。
　　為探索AFAP-

11、120 c.1621C>T(p.P541S）導致CMT2發(fā)生的機制，研究AFAP-120及NINS結構域的功能，我們在分子和細胞水平進行了實驗。利用免疫共沉淀的方法外源檢測了AFAP-120與其結合蛋白相互作用的變化，結果發(fā)現AFAP-120（P541S）結合β-actin蛋白的量增加，約為AFAP-120（WT）的1.5倍；利用免疫熒光實驗檢測了AFAP-120（P541S）對細胞微絲骨架的影響，結果顯示在SH-SY5Y細胞內AFAP

12、-120（P541S）突變蛋白與微絲纏繞形成斑點狀結構。微絲是細胞骨架的重要組成，微絲骨架重塑不僅影響神經元及雪旺氏細胞的形態(tài)，而且通過調節(jié)髓鞘蛋白的表達影響髓鞘的形成。作為一個微絲結合蛋白，AFAP-120突變后可能通過改變微絲骨架的結構導致CMT2的發(fā)生。
　　總結，我們發(fā)現了一個新的CMT2亞型及其致病基因AFAP-120 c.1621C>T(p.P541S)；構建了AFAP-120P542S轉基因小鼠模型，發(fā)現轉基因小鼠軸

13、索發(fā)生了與CMT2患者相同的病變；對AFAP-120（P541S）突變導致CMT2的分子機制進行了探索，發(fā)現AFAP-120蛋白NINS結構域發(fā)生P541S點突變后，結合的微絲蛋白增多，微絲骨架結構發(fā)生改變。本文研究不僅為山東CMT2家系潛在患者的提前診斷、及時診治以及該家系成員的遺傳咨詢和產前診斷提供了依據，而且為相關CMT2患者的基因診斷提供了參考。此外，本文對CMT2新治療藥物的開發(fā)以及AFAP-120蛋白功能的研究也有借鑒意義。