肌萎縮側(cè)索硬化的臨床、電生理特點及致病機制研究.pdf

1、肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是成人運動神經(jīng)元病最常見的類型，由Charcot于1869年首先描述。ALS與其他運動神經(jīng)元病的區(qū)別是上運動神經(jīng)元和下運動神經(jīng)元均發(fā)生變性。ALS主要的神經(jīng)病理特征包括脊髓前角及腦干運動神經(jīng)元廣泛損失、皮質(zhì)脊髓束變性和初級運動皮質(zhì)大錐體神經(jīng)元變性及損失。ALS的患病率約為5-7/10萬，大多數(shù)ALS病例為散發(fā)性(sALS)，5-10％為家族性(fALS)

2、。無論患者是散發(fā)性還是家族性，均會發(fā)生進行性肌肉無力和肌肉萎縮。進行性肌肉無力可始于上肢或下肢的近端或遠端，并可累及所有肌肉，包括與呼吸、言語及吞咽有關(guān)的肌肉。多數(shù)患者在被診斷2-5年后，死于呼吸衰竭。
　　在疾病早期，下運動神經(jīng)元和上運動神經(jīng)元受累的不同模式使ALS的診斷面臨挑戰(zhàn)。由于ALS最初癥狀與其他脊髓疾病、周圍神經(jīng)病變及神經(jīng)綜合征相似，因而診斷延遲是其主要問題之一。由于缺乏特異的疾病標(biāo)志，ALS臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的建立基于下運

3、動神經(jīng)元和上運動神經(jīng)元病變的存在及分布，并且需要使用排除過程來確定診斷。實驗室檢查、神經(jīng)影像和肌肉活檢都可能有助于鑒別診斷和排除與ALS類似的疾病過程，而一旦其他疾病過程被排除，電生理評估是確立ALS診斷的關(guān)鍵。并且，電生理評價不僅在疾病診斷中有用，而且有助于監(jiān)測疾病的進展和對干預(yù)的反應(yīng)，有助于確定預(yù)后。因此，目前ALS診斷主要依靠臨床表現(xiàn)與神經(jīng)電生理檢查相結(jié)合。
　　目前被識別的引起ALS的基因突變超過20種，其中最常見的突變發(fā)

4、生于SOD1、RNA結(jié)合蛋白編碼基因TARDBP、FUS，以及最近所認識C9orf72基因。2011年，C9orf72基因非編碼區(qū)六核苷酸GGGGCC的致病性重復(fù)擴增現(xiàn)象在ALS和額顳葉癡呆患者中被發(fā)現(xiàn)并報道。通過對9p21位點上風(fēng)險單倍型的研究認識到C9orf72基因中GGGGCC擴增。應(yīng)用重復(fù)引物聚合酶鏈反應(yīng)的測序，最終認為至少30次的重復(fù)擴增與ALS有關(guān)。與非C9orf72 ALS病例相比，C9orf72相關(guān)性ALS有其臨床特征，

5、伴發(fā)額顳葉癡呆的比例明顯增高，容易出現(xiàn)認知功能障礙和精神行為異常，延髓起病的比例增高，發(fā)病年齡提前1.8-5.0年，運動癥狀惡化速度快，病程縮短5.7-12.0月，顯示了其更強的疾病進程。同時，C9orf72疾病譜還包括原發(fā)性側(cè)索硬化、進行性肌萎縮、帕金森綜合征/帕金森病、亨廷頓病、阿爾茨海默病等。由于攜帶C9orf72基因突變的患者數(shù)量眾多，并且C9orf72相關(guān)疾病譜非常廣泛，其介導(dǎo)的ALS是多方面且復(fù)雜的，近年來C9orf72基因

6、逐漸成為研究熱點。
　　核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)是淋巴細胞中的一種誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子，對身體中幾乎所有細胞類型都產(chǎn)生影響，在炎癥、免疫反應(yīng)、細胞周期和細胞存活中起重要作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，NF-κB轉(zhuǎn)錄因子是神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)突生成及突觸可塑性等許多生理過程的關(guān)鍵參與者。NF-κB為組成型活性，參與神經(jīng)元細胞體中的神經(jīng)元損傷以及神經(jīng)保護。NF-κB在突觸中以潛在形式存在，只有當(dāng)其被激活時，才能

7、被運輸?shù)缴窠?jīng)元細胞核。免疫組化證實，NF-κB可在家族和散發(fā)ALS患者的神經(jīng)膠質(zhì)中被活化。研究表明，SOD1-G93A小膠質(zhì)細胞在NF-κB依賴性機制中在體內(nèi)及體外均可誘導(dǎo)運動神經(jīng)元死亡。
　　第一部分肌萎縮側(cè)索硬化的臨床及電生理特點分析
　　目的:
　　通過分析ALS臨床及電生理資料，為臨床醫(yī)生提供本病較為直觀和深入的認識，使患者盡可能得到早期診斷，從而獲得正確的治療，以期患者的生存期得以延長，生活質(zhì)量得以提高。

8、r>　　方法:
　　收集2009年1月至2016年6月在我院神經(jīng)內(nèi)科就診的73例患者，符合ElEscorial修訂版診斷標(biāo)準(zhǔn)，診斷分級為臨床確診及臨床擬診。進行詳盡的病史詢問及神經(jīng)查體，收集患者的發(fā)病年齡、起病部位、累及部位、主要的癥狀及體征，進行運動傳導(dǎo)速度(motor conduction velocity，MCV)測定、感覺傳導(dǎo)速度(sensoryconduction velocity，SCV)測定、重復(fù)神經(jīng)刺激(repet

9、itive nerve stimulation，RNS)、針電極肌電圖(EMG)等電生理檢查，回顧性分析、總結(jié)ALS的臨床及電生理特點。
　　結(jié)果:
　　患者共73例，其中男42例(57.5％)，女性31例(42.5％)，男女比例為1.4∶1。發(fā)病年齡28.1-78.8歲，平均發(fā)病年齡（51.7±12.4）歲。發(fā)病年齡高峰為51-60歲。起病部位比率最高的頸段為56.2％，其次為腰骶段(24.6％)和延髓段(19.2％)。常

10、見的下運動神經(jīng)元癥狀及體征中肌肉無力(97.3％)和肌肉萎縮(76.7％)最常見。運動神經(jīng)傳導(dǎo)總的異常率為45.9％，但運動傳導(dǎo)的遠端潛伏期、波幅及傳導(dǎo)速度的平均值均在正常范圍。復(fù)合肌肉動作電位(compound muscle actionpotential，CMAP)波幅值與截斷值的比值，正中神經(jīng)平均值為（1.06±0.74），尺神經(jīng)平均值為（1.49±0.81），尺神經(jīng)明顯大于正中神經(jīng)(P=0.000)。感覺神經(jīng)傳導(dǎo)總的異常率為2.

11、3％，但感覺傳導(dǎo)的波幅及傳導(dǎo)速度的平均值均在正常范圍。重復(fù)神經(jīng)刺激，拇短展?。ㄕ猩窠?jīng)支配）和小指展?。ǔ呱窠?jīng)支配）記錄的CMAP波幅遞減的平均值分別為（9.07％±8.68％）和（2.89％±2.47％），拇短展肌的遞減幅度明顯大于小指展肌(P=0.000)。在正中神經(jīng)，CMAP遞減和CMAP的波幅呈負相關(guān)（R=-0.357，P=0.000），而在尺神經(jīng)，沒有觀察到相關(guān)性（P=0.223）。針電極EMG顯示，舌肌總的自發(fā)電位及纖顫/正

12、尖波、束顫電位的出現(xiàn)率（分別為79.1％、65.1％、58.1％）均比胸鎖乳突?。ǚ謩e為48.8％、30.2％、32.6％）高（P值分別為0.004，0.001，0.017）。具有延髓癥狀和僅具肢體癥狀的患者，其舌肌自發(fā)電位的出現(xiàn)率分別為84.2％和75.0％，二者相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.708)。
　　結(jié)論:
　　ALS發(fā)病男性多于女性，好發(fā)于中老年人，發(fā)病高峰為51-60歲。起病部位以頸段最多，其次為腰骶段、延髓段。下

13、運動神經(jīng)元癥狀以肌肉無力最多見，其次為肌肉萎縮。部分患者會出現(xiàn)運動傳導(dǎo)異常，以CMAP波幅下降最為多見。感覺傳導(dǎo)異常少見，說明本病對感覺傳導(dǎo)通路影響不大;如果出現(xiàn)異常，并不能完全排除本病，應(yīng)注意排除伴隨的其他周圍神經(jīng)病。RNS檢查表明，正中神經(jīng)比尺神經(jīng)CMAP波幅遞減的幅度大，其原因是在ALS的病理生理中正中神經(jīng)較尺神經(jīng)優(yōu)先受累。CMAP遞減可能由新芽生的神經(jīng)末梢傳導(dǎo)不穩(wěn)定引起。在評估舌肌的臨床和亞臨床受累方面，無論是延髓起病還是肢體起

14、病的ALS，舌肌針電極EMG均是一種有價值的電生理方法，但應(yīng)注意操作方法。
　　第二部分 ALS突變基因C9orf72細胞模型的生物學(xué)功能分析及其機制的研究
　　目的:
　　構(gòu)建C9orf72誘導(dǎo)的ALS細胞模型并對其進行生物學(xué)功能分析;檢測C9orf72是否通過NF-κB信號通路造成神經(jīng)元損傷。
　　方法:
　　利用化學(xué)合成方法，體外獲得C9orf72的突變基因，然后構(gòu)建基因的真核表達載體;應(yīng)用陽離子脂質(zhì)

15、體轉(zhuǎn)染法，將上述構(gòu)建成功的真核表達載體轉(zhuǎn)染到NSC-34細胞中，使用RT-PCR和Western blots方法，分別在轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組進行檢測，確認細胞模型構(gòu)建成功;使用免疫細胞化學(xué)方法，進行神經(jīng)元細胞的形態(tài)學(xué)檢測;使用丙二醛(MDA)方法，檢測細胞氧化應(yīng)激情況;實驗組與對照組，應(yīng)用RT-PCR和Western blots方法，進行NF-κB信號通路活性檢測;將siRNA-NF-κB轉(zhuǎn)染到NSC-34細胞中，應(yīng)用Western blo

16、ts方法，研究NF-κB信號通路中，實驗組與對照組的上下游蛋白分子變化，根據(jù)變化情況去闡明C9orf72誘導(dǎo)的ALS發(fā)生的分子機制。
　　結(jié)果:
　　獲得轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-(CATCATCACCATCACCAT)(GGGGCC)30成功的細胞模型。免疫細胞化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-(CATCATCACCATCACCAT)(GGGGCC)30后，胞體明顯變圓，突起減少，且軸突變短。MDA

17、結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組為（2.92±0.14）nmol/mgprot，正常組為（1.63±0.12）nmol/mgprot，空載組為（1.82±0.21）nmol/mgprot，轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi) MDA的含量明顯高于其他兩組(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-(CATCATCACCATCACCAT)(GGGGCC)3024小時后，以正常細胞組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)組作為對照組，與對照組相比較，轉(zhuǎn)染組中細胞內(nèi)的p-NF-κB蛋白表達

18、明顯升高（P＜0.05）。轉(zhuǎn)染siRNA-NF-κB24小時后，與siRNA轉(zhuǎn)染組相比較，siRNA-NF-κB轉(zhuǎn)染組中細胞內(nèi)的NF-κB表達受到明顯的抑制（P＜0.05）;但是C9orf72蛋白的表達無變化。正常組、空載體組、pcDNA3.1(+)-(CATCATCACCATCACCAT)(GGGGCC)30轉(zhuǎn)染組與siRNA-NF-κB轉(zhuǎn)染組的MDA含量分別為（1.72±0.22）nmol/mgprot、（1.86±0.37）nmo

19、l/mgprot、（3.12±0.28）nmol/mgprot、（1.75±0.18）nmol/mgprot。統(tǒng)計學(xué)分析顯示，pcDNA3.1(+)-(CATCATCACCATCACCAT)(GGGGCC)30轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)的MDA含量明顯高于其他三組細胞(P＜0.05)，而siRNA-NF-κB轉(zhuǎn)染組的MDA含量與正常組和空載體組相比沒有明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　本研究成功構(gòu)建了C9orf72誘導(dǎo)的ALS細