血糖調(diào)節(jié)相關(guān)基因Prominin的功能分析及基因芯片技術(shù)篩查2型糖尿病相關(guān)基因.pdf

1、本文采用由差異顯示技術(shù)從大鼠血糖調(diào)節(jié)模型中克隆得到一個(gè)血糖調(diào)節(jié)相關(guān)基因作為研究對(duì)象，即葡萄糖刺激后表達(dá)上調(diào)的Prominin基因。Prominin屬于一個(gè)新的五次跨膜糖蛋白家族，該家族與任何已知蛋白均無(wú)明顯同源性，且特異性定位于細(xì)胞膜突起的頂端。目前，這個(gè)蛋白家族的生物學(xué)功能尚不明了，僅能夠根據(jù)些許線索推測(cè)出其與細(xì)胞骨架關(guān)系密切。 本文在細(xì)胞水平對(duì)Prominin與葡萄糖代謝之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。在大鼠L6肌管細(xì)胞中，采用rea

2、l-time PCR技術(shù)對(duì)葡萄糖刺激后的Prominin mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，隨著葡萄糖刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，其mRNA的含量也逐漸升高。這與大鼠整體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械玫降慕Y(jié)論一致。在野生型不表達(dá)Prominin的MDCK腎小管內(nèi)皮細(xì)胞中，使用自制的抗Prominin多克隆抗體通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)得到Prominin蛋白，對(duì)其進(jìn)行體外磷酸化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)了包括第二個(gè)胞內(nèi)區(qū)在內(nèi)的多個(gè)PKC磷酸化位點(diǎn)。采用高濃度葡萄糖和胰島素分別刺激誘導(dǎo)完全的L6肌

3、管細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)葡萄糖能夠引起Prominin磷酸化程度呈現(xiàn)先輕度增加、后大幅下降的變化，而胰島素能夠逆轉(zhuǎn)該變化，使之對(duì)葡萄糖刺激不敏感。 根據(jù)Prominin的亞細(xì)胞定位特征和其他實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果，我們探討了其參與細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng)的可能性。在野生型不表達(dá)Prominin的MDCK細(xì)胞中，Prominin的表達(dá)使之形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞體積變大，邊界清晰，出現(xiàn)大而細(xì)長(zhǎng)的突起，呈分散生長(zhǎng)：也使：MDCK細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)，達(dá)到對(duì)照的4

4、倍以上。采用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)大鼠骨骼肌文庫(kù)進(jìn)行篩選，得到了與Prominin第一個(gè)胞內(nèi)區(qū)結(jié)合的細(xì)胞骨架蛋白Myotilin，并且免疫共沉淀和細(xì)胞內(nèi)共定位的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了所述結(jié)合的存在。在L6細(xì)胞中，隨著細(xì)胞的接觸和分化，Prominin蛋白的含量逐漸下降；隨著細(xì)胞的死亡和去接觸，其蛋白含量逐步增加。 基因芯片是近年來(lái)出現(xiàn)的新技術(shù)，可用于高通量研究基因表達(dá)譜，篩選差異表達(dá)基因。通過(guò)該技術(shù)，我們對(duì)42例2型糖尿病患者和正常對(duì)照的骨