2型糖尿病相關(guān)基因的研究.pdf

1、目的：糖尿病(diabetes mellitus，DM)和肥胖(obesity，0B)均是由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用而引起的代謝異常性疾病。大量的研究結(jié)果表明，基因的多態(tài)性與肥胖和糖尿病的發(fā)生有著密切的關(guān)系，基因的多態(tài)性是肥胖和糖尿病發(fā)生的重要遺傳因素。 線粒體內(nèi)含有DNA，還含有自身的蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，是核外的另一遺傳基因攜帶體。細(xì)胞核基因遺傳和線粒體基因遺傳雖各自相對(duì)獨(dú)立，但二者之間也存在相互依存，相互影響。 目前

2、，核基因組(nDNA)和線粒體基因組(mtDNA)基因變異導(dǎo)致糖尿病發(fā)生的研究均取得了一定的進(jìn)展，而對(duì)于肥胖的發(fā)生，學(xué)者們的關(guān)注點(diǎn)仍停留在肥胖與生活方式與飲食結(jié)構(gòu)的關(guān)系上，肥胖易感基因的研究只限于核基因的篩查，尚未涉及到線粒體基因。 核基因Foxa2 (Forkhead boxa2)是翼螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族的一個(gè)成員，F(xiàn)oxa2是肝臟重要代謝基因的轉(zhuǎn)錄激活因子，其活性可以被胰島素抑制。有研究證實(shí)，空腹?fàn)顟B(tài)下，低胰島素水平可激活Fox

3、01和Foxa2，F(xiàn)oxol的激活可導(dǎo)致葡萄糖異生增加，F(xiàn)oxa2的激活則導(dǎo)致脂肪酸β氧化及酮體形成增加和極低密度脂蛋白合成增多。在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，減弱的胰島素信號(hào)不能抑制Foxol但能抑制Foxa2的活性，導(dǎo)致葡萄糖異生增加，脂肪酸β氧化減少和極低密度脂蛋白合成減少，這些改變可導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生。 近年來(lái)，線粒體基因突變導(dǎo)致糖尿病發(fā)生的研究也取得了很大的進(jìn)展，約有10余種線粒體基因突變被發(fā)現(xiàn)與糖尿病發(fā)生有關(guān)。迄今為止，國(guó)

4、內(nèi)外還沒有關(guān)于線粒體基因突變導(dǎo)致肥胖發(fā)生的相關(guān)性研究的報(bào)道。但是，線粒體的氧化磷酸化過(guò)程與人體的能量代謝密切相關(guān)，而且線粒體呼吸鏈中多肽功能的異常或量的減少，可干擾三羧酸循環(huán)的順利進(jìn)行，因此線粒體的異常也可能對(duì)肥胖的形成有一定的影響。 因此，在核基因組方面，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大連市2型糖尿病患者的外周血白細(xì)胞中的：foxa2基因的啟動(dòng)子(promotor)和外顯子(exon)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，篩查突變點(diǎn)(SNP)，并進(jìn)一步觀察基因突變?cè)斐?/p>

5、的Foxa2基因功能異常與2型糖尿病之間的關(guān)系。在線粒體基因組方面，從Www．mitomap．org提供的眾多mtDNA SNP中選取了在日本2型糖尿病人群測(cè)序中發(fā)現(xiàn)的但在國(guó)內(nèi)外未被報(bào)道的與2型糖尿病和肥胖有關(guān)聯(lián)的mtDNAA3537G、A4824G、A5351G、C6960T作為研究位點(diǎn)，研究線粒體DNA突變與肥胖和2型糖尿病的關(guān)系。 第一部分：foxa2基因突變與2型糖尿病相關(guān)性研究 研究對(duì)象和方法： 檢測(cè)

6、人群均來(lái)自大連市2型糖尿病患者，其中包括2005年1月至2006年2月大連地區(qū)2型糖尿病家系調(diào)查中收集到的患者61人(每家系中隨機(jī)選取1人)，國(guó)家95攻關(guān)糖尿病普查大連地區(qū)散發(fā)2型糖尿病患者56人以及大連市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科住院的糖尿病患者28人，共計(jì)145人，其中男性63人，女性82人。平均年齡56.56±13.62歲。非糖尿病者(NGT)均是普查中的健康人群，共334人，其中包括男性188人，女性146人，平均年齡52.31±10.5

7、9歲。健康人群入選標(biāo)準(zhǔn)為空腹血糖<5.6mmol/L，OGTT<7.8mmol/L，無(wú)其他內(nèi)分泌疾病，無(wú)糖尿病家族史。確定樣本后，采集血樣，提取有核細(xì)胞基因組DNA，根據(jù)Foxa2序列設(shè)計(jì)引物，用多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)擴(kuò)增含有foxa2基因啟動(dòng)子和外顯子所在的基因片斷，對(duì)基因片斷進(jìn)行測(cè)序，篩查突變點(diǎn)(SNP)。 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)利用PCR技術(shù)對(duì)大連市2型糖尿病病人及健康人外周血白細(xì)胞DNA中Foxa2基因的編碼區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)

8、增片斷進(jìn)行測(cè)序。與健康人群對(duì)照，在foxa2基因啟動(dòng)子和外顯子所在的基因片斷上未發(fā)現(xiàn)SNP。 結(jié)論：在大連市2型糖尿病病人Foxa2基因啟動(dòng)子和外顯子區(qū)域內(nèi)未發(fā)現(xiàn)突變點(diǎn)，說(shuō)明foxa2可能為高度保守性基因，大連2型糖尿病人群的糖尿病發(fā)病并非由Foxa2的基因突變所引起，而可能是由轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子復(fù)合物中其他調(diào)節(jié)子的變異所致。 第二部分：線粒體DNA A3537G、A4824G、．A5351G、C6960T 4點(diǎn)多態(tài)性與肥胖及

9、2型糖尿病的相關(guān)性 研究對(duì)象及方法：研究對(duì)象均來(lái)自廣西公務(wù)員體檢人群中的超重和肥胖患者，共計(jì)496人，其中超重患者96人，男性60人，女性36人，平均年齡46.33±6.25歲；肥胖患者400人，其中男性280人，女性120人，平均年齡47.52±3.85歲。對(duì)照組為廣西地區(qū)體檢的健康對(duì)照人群137人，其中包括男性48人，女性89人，平均年齡45.47±5.50歲，BMI<23。確定樣本后，采集血樣，提取有核細(xì)胞基因組DNA，根

10、據(jù)線粒體DNA序列設(shè)計(jì)引物，用多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)擴(kuò)增含有A3537G、A4824：G、A5351G、C6960T的所需片段，片斷長(zhǎng)度分別為557bP、658bP、505bP，541bP，然后分別用AluI、BstEII、HhaI、Bg Ⅱ內(nèi)切酶在37℃恒溫空氣循環(huán)箱中消化過(guò)夜，以8％聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳分離酶切產(chǎn)物，鑒別不同的基因型(AA、GG、CC、TT)。分別比較超重/肥胖組與對(duì)照組，同時(shí)對(duì)四個(gè)位點(diǎn)所構(gòu)成的單倍型進(jìn)

11、行分析。 結(jié)果： 1、廣西人群肥胖實(shí)驗(yàn)分組標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該采用2000年國(guó)際肥胖特別工作組提出的亞洲成年人BMI：分組標(biāo)準(zhǔn)。 2、在mtDNA A3537G．A4824G，A5351G，C6960T 4點(diǎn)多態(tài)性與肥胖的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，只有A5351G點(diǎn)突變率在單純肥胖組與健康對(duì)照組的比較中有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：X<'2>=7.41，P=0.006，OR=3.53，95％CI=1.35～6.29。由于A5351G是同義突

12、變，因此提示A5357G突變點(diǎn)周圍可能存在與廣西體檢人群肥胖相關(guān)的連鎖不平衡風(fēng)險(xiǎn)基因突變位點(diǎn)，而與廣西體檢人群超重沒有相關(guān)性。 3、在mtDNA A3537G．A4824G，A5351G，C6960T 4點(diǎn)多態(tài)性與肥胖伴糖尿病的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，4點(diǎn)突變率在0B+DM組和對(duì)照組間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示4點(diǎn)突變可能與廣西體檢肥胖患者中糖尿病的發(fā)生無(wú)相關(guān)性。 4、在mtDNA A3537G．A4824G，A5351G，C6

13、960T 4點(diǎn)多態(tài)性與肥胖伴糖耐量異常(IGT)的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，只有A535 1G點(diǎn)突變率在0B+IGT組和對(duì)照組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異：X<'25>=8.296，P=0.004，OR=4.40，95％CI=1.49～9.63。由于A5351G是同義突變，因此提示，A5351G突變點(diǎn)周圍可能存在與廣西體檢肥胖患者中糖耐量異常發(fā)生相關(guān)連鎖不平衡風(fēng)險(xiǎn)基因突變位點(diǎn)。 5、在mtDNA A3537G．A4824G，A5351G，C696

14、0T 4點(diǎn)多態(tài)性與超重(OW)伴糖尿病/糖耐量異常的相關(guān)性研究中發(fā)現(xiàn)，4點(diǎn)突變率在OW+DM+IGT和對(duì)照組間均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示，mtDNA A3537G．A4824G，A5351G，C6960T4點(diǎn)突變與超重組糖尿病/糖耐量異常無(wú)明顯相關(guān)性。 6、mtDNA A3537G．A4824G，A5351G，C6960T4：點(diǎn)共檢出5種單倍型，只有單倍型AAGC(G為5351點(diǎn)A突變成G)在病例一對(duì)照組的分布有顯著性差異(fre