EMS誘變及稻瘟病候選基因功能研究.pdf

1、隨著水稻全基因組測序工作的完成，人們把目標(biāo)轉(zhuǎn)向的功能基因組的研究，候選基因方法是功能基因組研究的重要方法之一，候選基因來源于不同的物種，在不同種物中又可以交叉使用，本研究候選基因的選用標(biāo)準(zhǔn)為1)候選基因序列在秈稻和粳稻中同時(shí)存在；2)在數(shù)據(jù)庫中標(biāo)注具有某種潛在功能：3)與稻瘟病有關(guān)的QTLs在相同的染色體區(qū)域。用EMS突變體做為這些候選基因的研究載體。EMS突變?yōu)閱螇A基突變，能夠獲得一系列等位基因。通過聯(lián)系等位基因與其表型多態(tài)性的關(guān)系來

2、確認(rèn)和評價(jià)基因的基本功能。用Agarose-TILLING方法篩選EMS單堿基突變位點(diǎn)。TILLING是由華盛頓洲立大學(xué)與美國Fred-Huchision癌癥研究中心共同開發(fā)的，最初應(yīng)用到擬南芥的研究上，產(chǎn)取得了成功，2002年第一次引入水稻研究中，2005年改進(jìn)為Agarose-TILLING。 研究使用2.0％和1.2％兩個(gè)濃度的化學(xué)誘變劑ethylmethanesul fonate(EMS)采用單次誘變和連續(xù)誘變的方法誘導(dǎo)

3、水稻IR64種子，構(gòu)建兩個(gè)不同的EMS群體-高劑量EMS群體(M<,2>E<'2.0>)和再突變EMS群體(M<,2>E<'2.0>R<,1.2>)，每個(gè)群體包含1600個(gè)突變個(gè)體。收集并保存了3200份突變體葉片和M<,2>，M<,3>種子，3072份DNA從凍干的葉片中分離出來，形成384個(gè)DNA混合池，每個(gè)混合池含8個(gè)DNA樣品。選擇11個(gè)與稻瘟病相關(guān)的候選基因做為研究對象，這些候選基因疑似編碼草酸氧化酶(oxalate oxid

4、ase)、熱激蛋白90(HeatShock Protein 90)和激酶(Kinase)，根據(jù)候選基因用CODDLE方法成功設(shè)計(jì)了11對特異性引物，其中，一次設(shè)計(jì)成功的引物有5個(gè)，其余6個(gè)為二次設(shè)計(jì)引物，引物的二次設(shè)計(jì)將引物的成功率提高55％。用Agarose-TILLING做為檢測單堿基突變位點(diǎn)的方法，本實(shí)驗(yàn)使用的CEL1內(nèi)切酶是從500克新鮮芹菜中提取的，共獲得CEL1酶粗液40ml，每一個(gè)酶切反應(yīng)可以使用0.2μL、0.15μL、

5、0.1μL、0.09μL、0.08μL或0.07μL酶粗液，以0.2μL做為本實(shí)驗(yàn)中的酶量。Agarose-TILLING共檢測到64個(gè)單堿基突變位點(diǎn)，經(jīng)測序后，驗(yàn)證了45個(gè)，檢測結(jié)果可信度為70.3％。再突變EMS群體的單堿基突變位點(diǎn)數(shù)(28)高于商劑量EMS群體(17)，突變頻率分別為1.29/Mb和0.79/Mb，高劑量EMS突變?nèi)后w的個(gè)體數(shù)量達(dá)到1300時(shí)突變基因可以覆蓋整個(gè)基因組：再突變EMS群體的個(gè)體數(shù)量達(dá)到800時(shí)突變基因

6、可以覆蓋整個(gè)基因組。再突變?nèi)后w上的錯(cuò)義突變(5)少于高劑量突突群體(8)，沉沒突變和內(nèi)含子上的無義突變則高于高劑量EMS群體。EMS在外顯子區(qū)上的誘導(dǎo)變異頻率(1.11/Mb)高于內(nèi)含子上的突變頻率(0.97/Mb)。5個(gè)EMS突變體M715、M93、M97、M183、M543分別攜帶5個(gè)突變基因ox1-7、ox-4、ox1-6、ox1-9-1、oxl-9-2。突變體問的抗瘟性有顯著差異(F=9.98，P<0.01)，抗瘟能力從高到低排

7、列依次為M183(7.3％)、M543(14.6％)、M93(14.7％)、M97(24.7％)、M715(39.8％)。5個(gè)突變基因均為稻瘟病防衛(wèi)反應(yīng)基因。突變基因ox1-7、ox-4、ox1-6、ox1-9-1、oxl-9-2之間的抗瘟性差異顯著(F=3.5626，P<0.01)。與野生基因型比較，基因ox1-9-1抗瘟能力最強(qiáng)，抗病貢獻(xiàn)率為48.7％；其次為ox1-9-2，抗病貢獻(xiàn)率為19.3％：基因ox-4、ox1-6、ox1-

8、7為感病基因，病葉貢獻(xiàn)率分別為4.0％、21.0％和30.0％。按抗瘟能力大小排列依次為ox1-9-1、ox1-9-2、 ox-4、ox1-6、 ox1-7。與相關(guān)研究相比具有二個(gè)特點(diǎn)，首先是方法創(chuàng)新，利用反向遺傳學(xué)方法，第一次把EMS突變體技術(shù)與以Agarose-TILLING方法結(jié)合起來，對水稻功能基因組的研究做了有意義的嘗試。Agarose-TILLING方法是本課題組引入到水稻研究中并第一次在本研究L}|應(yīng)用，相關(guān)文章發(fā)表在國際