稻瘟病新抗性基因Pita2候選基因的功能研究.pdf

1、水稻作為一種重要的糧食作物,在全球糧食生產(chǎn)和消費(fèi)中占有舉足輕重的地位。稻瘟病,對我國所有的稻作區(qū)而言都是極為嚴(yán)重的水稻病害之一。從環(huán)境保護(hù)與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的長遠(yuǎn)視野來看,培育和合理利用新抗病品種是控制稻瘟病害最經(jīng)濟(jì)有效和對環(huán)境最安全的手段。因此,針對新抗稻瘟病基因的克隆研究對抗病育種就具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。為了快速準(zhǔn)確地克隆粳稻PiNo.4的稻瘟病抗性基因Pita2,本研究在前期目的基因精細(xì)定位、物理作圖的基礎(chǔ)上,旨在對稻瘟病抗性基因

2、Pita2候選基因的功能進(jìn)行初步分析,主要研究結(jié)果包括:
　　1)采用傳統(tǒng)的多次酶切連接技術(shù)構(gòu)建稻瘟病抗性基因Pita2三個候選基因Pita2-1、Pita2-3、Pita2-4的RNAi載體,克隆到植物干涉載體pMCG161上,通過測序分析驗(yàn)證成功構(gòu)建了三個RNAi載體。
　　2)將已構(gòu)建好的三個RNAi載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入Pita2供體品種PiNo.4進(jìn)行功能驗(yàn)證分析,結(jié)果共鑒定出T0陽性轉(zhuǎn)化苗T1Ri1

3、0棵、T3Ri16棵、T4Ri22棵。進(jìn)一步通過qRT-PCR對陽性轉(zhuǎn)化苗進(jìn)行目標(biāo)基因的表達(dá)分析,結(jié)果顯示與非轉(zhuǎn)化受體PiNo.4相比,陽性轉(zhuǎn)基因植株的Pita2候選基因相對表達(dá)量均有所下調(diào)。由于水稻遺傳轉(zhuǎn)化的周期較長,轉(zhuǎn)化苗獲得時間較晚。目前已收獲T1代的種子,下階段將對T1代轉(zhuǎn)化株進(jìn)行稻瘟病的抗性鑒定。
　　3)通過EMS化學(xué)誘變處理Pita2近等基因系日本晴種子NB-Pita2約20000粒,單株收取突變體種子,共獲得M1代

4、約4200份株系,接種Pita2的無毒稻瘟病菌株研53-33,篩選其感病突變株,現(xiàn)共獲得36份感病株系,供作下階段M2代抗病性鑒定及分子檢測。
　　4)以抗性基因Pita2的近等基因系NB-Pita2和NB為實(shí)驗(yàn)材料,通過實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)研究Pita2介導(dǎo)的抗性反應(yīng)中相關(guān)基因WRKY45、JAmyb、SalT、HSP90、SGT、RAR1、PBZ、PR1b在接種稻瘟病菌研53-33前后的相對表達(dá)量,分析這些基因在Pita2介