黑殼子粳抗稻瘟病基因Pi-hkl候選基因的克隆和初步功能驗(yàn)證.pdf

1、由子囊菌Magnaportheoryzae引起的稻瘟病是世界性水稻病害之一，嚴(yán)重威脅水稻生產(chǎn)。開(kāi)展抗稻瘟病新基因的鑒定和功能分析對(duì)抗病育種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。太湖流域的地方粳稻品種黑殼子粳是一個(gè)廣譜高抗的水稻品種，對(duì)多個(gè)稻瘟病菌株表現(xiàn)穩(wěn)定持久的抗性。前期研究通過(guò)日本鑒別菌株北1在11號(hào)染色體上定位到主效抗稻瘟病性基因Pi-hk1，進(jìn)一步定位于RM7654和In5區(qū)間內(nèi)。本研究在Pi-hk1前期精細(xì)定位和物理作圖的基礎(chǔ)上，對(duì)候選基因進(jìn)行克

2、隆、生物信息學(xué)分析和表達(dá)分析，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)候選基因進(jìn)行了初步功能分析，結(jié)果如下:
　　1.定位區(qū)間內(nèi)有4個(gè)ORF:P13編碼含有MybDNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白，與日本晴序列一致，與感病品種蘇御糯存在一個(gè)氨基酸的差異;P14是反轉(zhuǎn)座子;P15和P16基因的編碼蛋白具有典型NBS-LRR抗病結(jié)構(gòu);P15蛋白在日本晴和蘇御糯中存在多處氨基酸插入與替換，并含有日本晴和蘇御糯中都不存在的兩個(gè)串聯(lián)的WRKY結(jié)

3、構(gòu)域;P16基因的編碼蛋白與日本晴的相似性達(dá)到92％。與日本晴中不同，黑殼子粳中P15、P16編碼方向相反，兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)相距189bp。
　　2.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)黑殼子粳和蘇御糯在稻瘟病菌接種0、4、8、12、24、48、72h后，3個(gè)候選基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明3個(gè)候選基因均為組成型表達(dá)，并明顯受到稻瘟病菌接種誘導(dǎo)。在抗病品種黑殼子粳中，稻瘟病菌脅迫4h后，3個(gè)基因的表達(dá)即有明顯上調(diào)，早于感病品種蘇

4、御糯中基因的表達(dá)。
　　3.擴(kuò)增3個(gè)候選基因的cDNA全長(zhǎng)或基因組編碼序列全長(zhǎng)，構(gòu)建候選基因的過(guò)表達(dá)載體;利用覆蓋定位區(qū)間的BAC質(zhì)粒，構(gòu)建了包含P15、P16基因組全長(zhǎng)的共轉(zhuǎn)化載體，并進(jìn)一步構(gòu)建了P15和P16的功能互補(bǔ)載體;以感病品種蘇御糯作為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，分別獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系。
　　4.對(duì)T2代P13過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系、T1代P16過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系進(jìn)行稻瘟病菌噴霧接種，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)P13和過(guò)表達(dá)