粳稻云引稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)的精細(xì)定位和圖位克隆.pdf

1、稻瘟病是由子囊菌 Magnaporthe oryzae(Hebert)Barr(無性世代為Pyricularia ogyzoe(Cooke)Sacc.)引起的廣泛發(fā)生在世界各稻區(qū)的最主要的病害之一。近年來其危害面積逐年擴(kuò)大,危害程度日趨嚴(yán)重,已成為水稻高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的主要障礙因素之一。傳統(tǒng)的抗病育種主要依賴于抗性鑒定和植株表型選擇,要求具有豐富的經(jīng)驗和長達(dá)數(shù)年甚至十幾年的時間。由于受稻瘟病發(fā)病條件的限制,以及缺乏對抗病基因有效的追蹤方法,常規(guī)

2、育種中很難選育出同時具有多個抗病基因的持久抗病品種。另一方面,抗病基因是植物.病原菌相互作用的一個關(guān)鍵因子,克隆抗病基因是研究植物抗病機(jī)制,揭示植物-病原菌相互作用機(jī)理的基礎(chǔ)。因此,對稻瘟病抗性基因進(jìn)行精細(xì)定位,尋找與之緊密連鎖的分子標(biāo)記和克隆稻瘟病抗性基因具有重要的意義。云引是引自云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院的常規(guī)粳稻品種,應(yīng)用多菌株混合田間注射接菌、室內(nèi)噴霧接菌和單一菌株離體鑒定的技術(shù)對粳稻云引進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定,結(jié)果表明云引能夠抗所接的60個

3、稻瘟病菌株中的58個菌株,說明云引具有較為廣譜的稻瘟病抗性。為更好地利用云引的稻瘟病抗性基因,本研究致力于對云引的稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)進(jìn)行精細(xì)定位和圖位克隆,得到了如下結(jié)果:
　　 (1)Pi-y43(t)基因的精細(xì)定位在將云引稻瘟病抗性基因精細(xì)定位在3.2cM范圍內(nèi)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)尋找公共的SSR標(biāo)記并結(jié)合新開發(fā)的5對新SSR標(biāo)記,構(gòu)建了目標(biāo)區(qū)域的電子物理圖,對稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)進(jìn)行了精細(xì)

4、定位,最終將Pi-y43(t)定位于標(biāo)記FJK42與RM14184之間0.64cM的區(qū)域內(nèi),構(gòu)建了Pi-y43(t)基因區(qū)域的精細(xì)遺傳圖,獲得了3個與目標(biāo)基因共分離的分子標(biāo)記,分別為RM6307、RM208及Pibdom。
　　 (2)目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的基因預(yù)測與候選基因的確定利用6種生物信息學(xué)軟件,分別是ORF Finder、RiceGAAS、Softberry三種軟件的預(yù)測及Gramene、RAPDB及RGAP三個數(shù)據(jù)庫的注釋分析

5、對稻瘟病抗性基因Pi-y43(t)所在的區(qū)域進(jìn)行基因預(yù)測,搜索具有抗病基因保守結(jié)構(gòu)的候選基因,對候選基因進(jìn)行了RT-PCR分析,確定了Piy43-3為唯一候選基因,測序結(jié)果表明與已克隆的稻瘟病抗性基因Pib同源性為99％。
　　 (3)候選基因Piy43-3的克隆及序列分析以PibCDS(AB013449.2)設(shè)計引物擴(kuò)增云引的cDNA,測序結(jié)果表明云引品種中含有完整的Pib基因的開放閱讀框；采取分段克隆測序策略,以Pib(AB

6、013448)基因序列設(shè)計引物,擴(kuò)增云引基因組DNA,經(jīng)測序拼接后搜索表明云引中含有完整的稻瘟病抗性基因Pib。
　　 (4)云引Pi-y43(t)基因與Pib基因的區(qū)別與聯(lián)系通過苗期噴霧接種及成株期人工注射接種,鑒定云引與Pib單基因系對稻瘟病菌株“四川-43”的抗、感反應(yīng),云引高抗“四川-43”菌株,而含Pib基因的單基因鑒別系對“四川-43”表現(xiàn)為中抗,表明云引的Pi-y43(t)與Pib基因?qū)Φ疚敛【辍八拇?3”抗性的

7、差異。
　　 (5)云引Pib同源基因Pib2的克隆及序列分析以Pib2(AB013450)基因序列設(shè)計引物擴(kuò)增云引及Pib單基因系基因組DNA,經(jīng)測序拼接后進(jìn)行BLAST分析,結(jié)果表明云引的Pib2基因存在多個位點的堿基變異。用FGENESH軟件對云引的Pib2與NCBI登錄的Pib2進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測比較,發(fā)現(xiàn)云引的Pib2由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成,氨基酸水平上與NCBI登陸的氨基酸序列比較,發(fā)生了大片段的缺失與變異。