利用RNA-Seq技術分析水稻稻瘟病持久抗性基因pi21的抗病機制.pdf

1、水稻（Oryza sativa）是世界上重要的糧食作物之一，而水稻稻瘟病等病害嚴重地制約著水稻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)。培育稻瘟病抗性品種尤其是持久抗性品種已成為治理水稻稻瘟病的主要方法之一。水稻稻瘟病持久抗性基因pi21在許多粳稻品種中存在，因此可以在世界范圍內(nèi)廣泛使用，以提高水稻的稻瘟病抗性。本研究以受稻瘟病菌接種誘導的Pi21-RNAi轉基因系和日本晴為材料，利用RNA-Seq測序技術對水稻與稻瘟菌（Magnaporthe grisea）的互作

2、進行研究，獲得如下研究成果:
　　1.本研究用兩種稻瘟病菌生理小種（TMC-1和GUY11）分別接種Pi21基因RNAi表達轉基因系241材料（抗?。┖腿毡厩纾ǜ胁φ詹牧希⒃诮臃N后五個時間點(0h、12h、24 h、48 h、72 h)分別取樣（葉片組織），共獲得20份受稻瘟病菌誘導的材料。半定量RT-PCR分析病程相關基因（WRKY，ABC，Kinase，MYB，pathogen-related gene等五類基因）在接種

3、材料中的表達量，發(fā)現(xiàn)抗感材料之間存在基因表達差異，并且材料在兩種稻瘟菌誘導后表現(xiàn)出相似的表達量變化，說明稻瘟病菌接種實驗效果較好，創(chuàng)制的材料能夠反映pi21與稻瘟病菌之間的互作關系。
　　2.采用RNA-Seq高通量測序技術對20個受稻瘟病菌誘導的水稻材料進行測序，共獲得約217M的Clean Reads，占Raw Reads的比例高達97.41％。每個樣品的Clean Reads數(shù)都在10M以上，測得的堿基數(shù)在500Mb以上。利

4、用SOAP短序列比對軟件將Clean Reads比對到水稻粳稻品種日本晴基因組序列上（允許兩個堿基錯配），結果顯示，17個樣品的比對比例在86.97％以上，另外3個樣品TMC-Nip-72h(75.85％)、GUY-Nip-72h(68.54％)、TMC-241-72h(75.19％)的比對比例相對較低。將Clean Reads比對到日本晴基因序列上時，也獲得一致的比對結果。測序飽和度分析顯示，當Clean Reads數(shù)大于10 M時，

5、測序深度已達到飽和。序列在基因的5'-3'方向分布大致均勻，說明樣品mRNA打斷隨機性好。這些指標均說明測序的數(shù)據(jù)質(zhì)量比較高。
　　3.利用RPKM法計算每個樣品中43222個水稻基因的基因表達量，發(fā)現(xiàn)每個樣品全部基因的RPKM平均值介于15.2～16.9之間，說明20個樣品mRNA轉錄的總水平一致。在|log2Ratio|≥1且FDR≤0.001的條件下，對兩兩樣品之間的差異表達基因進行篩選。這些差異基因為下一步篩選與pi21抗