水稻和紅麻雄性不育相關基因MS5的克隆、表達及轉基因研究.pdf

1、MS5(male sterile5)基因又名POLLENLESS3基因或TDM1基因。MS5最早在擬南芥發(fā)現，且是一個育性相關的基因，MS5突變會導致雄性不育。相關研究顯示，它在調控細胞周期活動及在發(fā)育的花藥細胞的減數分裂過程中起著關鍵作用。MS5突變體由于在第二次減數分裂后出現了一次額外的分裂，而染色體沒有復制，結果導致染色體異常，出現多分體。其編碼的蛋白產物類似小鼠聯會復合體蛋白SCP1，遺傳分析顯示它是一個細胞核隱性孢子突變體(C

2、haudhury et al.，1994)。MS5基因屬于一個植物界中高度保守的小的多基因家族的成員。
　　 李剛(2009)采用同重標簽相對與絕對定量(iTRAQ)標記分析了紅麻不育系L23A和保持系L23B單核期花藥線粒體的蛋白質組差異，共鑒定出93個顯著差異的蛋白質。在所鑒定的差異蛋白中，將No.326蛋白與水稻蛋白質數庫進行比對，鑒定出No.326蛋白與POLLENLESS3基因高度同源，POLLENLESS3，又名MS

3、5基因。本研究基于從李剛研究結果，再次通過搜索比對各核酸及蛋白數據庫，從水稻基因組序列里選擇與紅麻No.326蛋白同源性最高的水稻POLLENLESS3的3個基因進行研究，其基因登陸號分別為為Os05943040，Os03906970和Os09936740。在水稻基因組數據庫里有4個MS5同源基因，其功能未被注釋。本研究將挑出來3個基因分別命名為OsMs5-1，OsMs5-2，OsMs5-3，并對這3個基因進行了序列分析，通過RNAi基

4、因沉默及超量表達來研究這3個基因的功能，同時我們還克隆了紅麻的MS5基因，并也作了序列分析及在水稻中超量表達，為了解決基因工程創(chuàng)造細胞核雄性不育系的保持問題，我們還對煙草EPSPS1進行功能研究，通過對水稻與紅麻MS5基因及煙草EPSPS1的功能研究，得出如下結果：
　　 1、3個水稻基因的分離與序列分析。我們從水稻分離OsMs5-1，OsMs5-2，OsMs5-3基因全長片段，對水稻OsMs5-1，OsMs5-2，OsMs5-

5、3基因進行生物信息學分析，3個MS5蛋白分別編碼含有299、315和515個氨基酸殘基的蛋白質。經Scanprosite軟件分析發(fā)現，3個MS5均含有一個TPR結構域(PS50005)，屬TPR蛋白家族成員。序列分析顯示OsMs5-1，OsMs5-2，OsMs5-3基因與擬南芥MS5基因高源同源，以上結果表明以上OsMs5-1，OsMs5-2，OsMs5-3蛋白是MS5基因的同源基因。
　　 2、為了對OsMs5-1，OsMs5

6、-2，OsMs5-3基因進行功能分析，我們通過構建水稻OsMs5-1，OsMs5-2，OsMs5-3，3個基因的RNAi干擾表達載體，并以中花11為受體材料用農桿菌介導法轉化水稻，分別獲得轉基因的陽性植株。對干擾表達轉基因植株T1代以nptⅡ基因片段為探針進行Southern分析證明，獲得了轉基因陽性植株。對3個基因的RNAi干擾轉基因水稻后代進行形態(tài)及光學顯微鏡和掃描電鏡觀察，結果顯示，T0代的轉基因植株表現不同程度的不育。轉基因植株

7、的花粉也不同于野生型植株花粉。
　　 3、構建水稻OsMs5-1、OsMs5-2和OsMs5-33個基因帶GFP標記基因的超量表達載體，并通過農桿菌介導法轉化水稻。并以粳稻中花11為受體材料，農桿菌介導法轉化水稻，分子鑒定獲得了陽性植株。為了對水稻OsMs5-1、OsMs5-2和OsMs5-3基因進行亞細胞定位預測，用3個帶GFP的轉基因植株的幼苗根尖與愈傷組織壓片置于熒光顯微下觀察綠色熒光蛋白GFP的表達。轉基因植株能觀察到被

8、藍光激發(fā)出耀眼的綠色熒光。
　　 4、為了研究MS5同源基因在紅麻(Hibiscus canabius L.)花藥中的轉錄特征，以不育系L23A為試材，基于已知的紅麻MS5基因5'端cDNA序列，采用3'RACE和RT-PCR技術對該基因全長cDNA序列進行了克隆。序列比對分析結果表明，紅麻花藥組織中同時存在MS5基因2種不同的轉錄本，其長度分別為972 bp和1105 bp，依次命名為HcMs5-α和HcMs5-β。這2種轉錄

9、本均包含了完整且一致的編碼序列(CDS)，全長為858 bp，預測編碼的蛋白質含有285個氨基酸殘基，相對分子量為32.4 kD，理論等電點為7.62。兩者5'端前972 bp序列完全一致，但3'端的非編碼區(qū)(UTR)長度有所不同，HcMs5-β在第972 bp以后比HcMs5-α多出133 bp的序列，具有選擇性轉錄終止的特征。這種轉錄終止信號的可選擇性可能與該基因轉錄后水平的調控有關。
　　 半定量RT-PCR分析紅麻不育系

10、和保持系MS5基因的時空表達，結果顯示，MS5基因在不育系和保持系中，在各個組織的表達沒有差異，其中無論是不育系和保持系，MS5基因在根、花瓣及雙核期花藥有表達，在莖，葉和單核期花藥，MS5基因的表達量極低。但據李剛(2009)的研究，紅麻該基因在蛋白水平上的表達量，在不育系和保持系之間差異顯著。由此推測可能與該基因轉錄后水平的調控有關。對紅麻HcMs5基因進行亞細胞定位預測，對GFP報告基因的轉基因植株的幼苗根尖與愈傷組織壓片置于熒光

11、顯微下觀察綠色熒光蛋白GFP的表達。轉基因植株能觀察到被藍光激發(fā)出耀眼的綠色熒光。
　　 5、EPSPS合酶(5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶)是莽草酸途徑中的一個關鍵酶，是除草劑草甘膦的作用靶標。草甘膦通過阻止EPSPS合酶的形成而使莽草酸途徑中止，從而達到對植物的滅殺作用。草甘膦是一種廣譜型滅生性除草劑，植物中EPSP合成酶的過量表達或某些活性位點氨基酸的突變對高劑量的草甘膦有較強的耐受性。為了利用基因工程創(chuàng)造細胞核雄性

12、不育系，對于基因工程創(chuàng)造細胞核雄性不育系的保持問題，我們設想以煙草TOB-EPSPSI基因作為篩選標記，篩選細胞核雄性不育后代的不育株與可育株，以解決不育系的保持問題。本研究對煙草的抗除草劑草甘膦TOB-EPSPSI基因進行了研究，將煙草的TOB-EPSPSI基因(基因登陸號M61904)構建了植物表達載體，并用農桿菌介導法導入水稻。分子鑒定證明煙草TOB-EPSPSI基因被成功整合到粳稻中花11受體材料中。對轉基因植株T2代進行草甘膦