KTI基因轉(zhuǎn)化花椰菜的研究.pdf

1、花椰菜(Brassica oleracea var. botryis)是我國常見的蔬菜之一，然而蟲害的發(fā)生造成花椰菜品質(zhì)下降和大幅度減產(chǎn)，已成為制約花椰菜生產(chǎn)的重要因素之一。利用基因工程技術(shù)培育抗蟲農(nóng)作物品種，已成為當(dāng)今植物蟲害防治的重要手段。一些重要抗蟲基因已經(jīng)成功分離并應(yīng)用于基因工程，為培育植物抗蟲品種開辟了一條安全有效的新途徑，具有重要的應(yīng)用價(jià)值和巨大的市場潛力。
　　 本研究將楊樹來源的抗蟲基因Kunitz型絲氨酸胰蛋白

2、酶抑制劑(KTI)基因連入具有人工合成的G10-90啟動(dòng)子的無抗生素抗性篩選標(biāo)記的表達(dá)載體pX6中，構(gòu)建了雙元表達(dá)載體pX6-KTI，具有在植物中表達(dá)的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因NPTⅡ以及cre基因，可在甾二醇誘導(dǎo)下去除NPTⅡ抗性標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)marker free。以花椰菜云山品種為供試材料，在原有報(bào)道的基礎(chǔ)上，建立和優(yōu)化了花椰菜再生、遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將目的基因KTI成功轉(zhuǎn)入受試品種，以獲得高抗蟲性的轉(zhuǎn)基因植株。獲得子葉柄

3、分化培養(yǎng)基MS+6-BA1mg/L+NAA0.025mg/L+Agar0.7％，下胚軸分化培養(yǎng)基MS+6-BA1mg/L+NAA0.1 mg/L+Agar0.7%，生根培養(yǎng)基1/2 MS+Agar0.5%；最優(yōu)的轉(zhuǎn)化條件為預(yù)培養(yǎng)2d，菌液稀釋后濃度為OD600值0.2-0.3，浸染30s，共培養(yǎng)2d。在脫菌和篩選階段添加Cef200 mg/L，分化階段的Kan篩選濃度為25 mg/L，生根階段的篩選濃度為15mg/L。通過Kan初步篩選