花椰菜小孢子發(fā)育過程中miRNAS的鑒定及調(diào)控特征研究.pdf

1、miRNA是植物中一類非常重要的非編碼調(diào)控的小RNA?；ㄒ?Brassicaoleracea var.bortytisL)是屬于十字花科蕓薹屬植物，大約在19世紀(jì)中葉傳入的我國。由于花椰菜在我國栽培的歷史時間較短，所以我國的花椰菜資源比較有限，遺傳變異也不夠豐富。近年來，隨著花椰菜育種的迅速發(fā)展，花椰菜遺傳多樣性的研究也越來越重要。本文主要研究花椰菜小孢子不同發(fā)育時期表達的miRNA，從表觀遺傳學(xué)的視角來研究花椰菜小孢子發(fā)育過程中mi

2、RNA的表達和變化特征，篩選、克隆與花椰菜小孢子發(fā)育相關(guān)的miRNA，進而對其調(diào)控特征及功能進行深入分析，主要研究結(jié)果如下:
　　1、利用Solexa測序技術(shù)，對花椰菜小孢子三個不同發(fā)育時期的全基因組小RNA進行了高通量測序以及生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，在花椰菜小孢子三個不同發(fā)育時期共得到112個已知的miRNA，共屬于37個家族，數(shù)字表達譜分析顯示，84個已知miRNA在小孢子不同發(fā)育階段呈現(xiàn)差異表達，這其中有22個miRNA表

3、現(xiàn)為顯著差異表達，進一步隨機對差異表達miRNAs:miR165a、miR172a、miR319c、miR391和miR858的表達特征進行了定量分析，結(jié)果與數(shù)字表達譜分析結(jié)果高度一致。
　　2、利用miRNA預(yù)測軟件，對花椰菜小孢子發(fā)育過程中未知miRNA進行預(yù)測，首次在花椰菜中預(yù)測到55個novel miRNA，并進一步對這些miRNA進行了頸環(huán)PCR擴增及重測序驗證。差異表達分析顯示，15個novel miRNA在花椰菜小孢

4、子發(fā)育過程中呈現(xiàn)差異表達，這其中11個novel miRNA的差異表達特征得到進一步的實驗驗證。
　　3、在獲得花椰菜小孢子已知及novel miRNA基礎(chǔ)上，依托花椰菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對相關(guān)miRNA的靶基因進行了預(yù)測及GO、KEGG等生物信息學(xué)分析，結(jié)果在Phase-1中97個已知miRNA預(yù)測到668個靶基因，20個新預(yù)測到的miRNA預(yù)測到26個靶基因;Phase-2中99個已知miRNA預(yù)測到676個靶基因，20個新預(yù)測到的m

5、iRNA預(yù)測到41個靶基因;在Phase-3中101個已知miRNA預(yù)測到218個靶基因，21個新miRNA預(yù)測到389個靶基因。進一步對這些miRNA候選靶基因差異表達特征進行了qRT—PCR分析，結(jié)果證實絕大多數(shù)候選靶基因的表達與其相應(yīng)的調(diào)控miRNA呈負(fù)相關(guān)。
　　4、采用5'RACE技術(shù)對部分miRNA靶基因的切割位點進行了進一步的驗證分析，結(jié)果證實相應(yīng)miRNA在預(yù)期位點對靶基因進行切割。
　　5、為進一步對花椰菜