花椰菜小孢子發(fā)育過(guò)程中miRNAS的鑒定及調(diào)控特征研究.pdf

1、miRNA是植物中一類非常重要的非編碼調(diào)控的小RNA?；ㄒ?Brassicaoleracea var.bortytisL)是屬于十字花科蕓薹屬植物，大約在19世紀(jì)中葉傳入的我國(guó)。由于花椰菜在我國(guó)栽培的歷史時(shí)間較短，所以我國(guó)的花椰菜資源比較有限，遺傳變異也不夠豐富。近年來(lái)，隨著花椰菜育種的迅速發(fā)展，花椰菜遺傳多樣性的研究也越來(lái)越重要。本文主要研究花椰菜小孢子不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)的miRNA，從表觀遺傳學(xué)的視角來(lái)研究花椰菜小孢子發(fā)育過(guò)程中mi

2、RNA的表達(dá)和變化特征，篩選、克隆與花椰菜小孢子發(fā)育相關(guān)的miRNA，進(jìn)而對(duì)其調(diào)控特征及功能進(jìn)行深入分析，主要研究結(jié)果如下:
　　1、利用Solexa測(cè)序技術(shù)，對(duì)花椰菜小孢子三個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的全基因組小RNA進(jìn)行了高通量測(cè)序以及生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示，在花椰菜小孢子三個(gè)不同發(fā)育時(shí)期共得到112個(gè)已知的miRNA，共屬于37個(gè)家族，數(shù)字表達(dá)譜分析顯示，84個(gè)已知miRNA在小孢子不同發(fā)育階段呈現(xiàn)差異表達(dá)，這其中有22個(gè)miRNA表

3、現(xiàn)為顯著差異表達(dá)，進(jìn)一步隨機(jī)對(duì)差異表達(dá)miRNAs:miR165a、miR172a、miR319c、miR391和miR858的表達(dá)特征進(jìn)行了定量分析，結(jié)果與數(shù)字表達(dá)譜分析結(jié)果高度一致。
　　2、利用miRNA預(yù)測(cè)軟件，對(duì)花椰菜小孢子發(fā)育過(guò)程中未知miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，首次在花椰菜中預(yù)測(cè)到55個(gè)novel miRNA，并進(jìn)一步對(duì)這些miRNA進(jìn)行了頸環(huán)PCR擴(kuò)增及重測(cè)序驗(yàn)證。差異表達(dá)分析顯示，15個(gè)novel miRNA在花椰菜小孢

4、子發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)差異表達(dá)，這其中11個(gè)novel miRNA的差異表達(dá)特征得到進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　3、在獲得花椰菜小孢子已知及novel miRNA基礎(chǔ)上，依托花椰菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)相關(guān)miRNA的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)及GO、KEGG等生物信息學(xué)分析，結(jié)果在Phase-1中97個(gè)已知miRNA預(yù)測(cè)到668個(gè)靶基因，20個(gè)新預(yù)測(cè)到的miRNA預(yù)測(cè)到26個(gè)靶基因;Phase-2中99個(gè)已知miRNA預(yù)測(cè)到676個(gè)靶基因，20個(gè)新預(yù)測(cè)到的m

5、iRNA預(yù)測(cè)到41個(gè)靶基因;在Phase-3中101個(gè)已知miRNA預(yù)測(cè)到218個(gè)靶基因，21個(gè)新miRNA預(yù)測(cè)到389個(gè)靶基因。進(jìn)一步對(duì)這些miRNA候選靶基因差異表達(dá)特征進(jìn)行了qRT—PCR分析，結(jié)果證實(shí)絕大多數(shù)候選靶基因的表達(dá)與其相應(yīng)的調(diào)控miRNA呈負(fù)相關(guān)。
　　4、采用5'RACE技術(shù)對(duì)部分miRNA靶基因的切割位點(diǎn)進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證分析，結(jié)果證實(shí)相應(yīng)miRNA在預(yù)期位點(diǎn)對(duì)靶基因進(jìn)行切割。
　　5、為進(jìn)一步對(duì)花椰菜